集約經營對毛竹林土壤反硝化細菌豐度的影響*

曹林樺，劉彩霞，劉 茗，方 偉，梁辰飛，秦 華，陳俊輝，徐秋芳?

（1. 浙江省森林生態系統碳循環與固碳減排重點實驗室，浙江農林大學，浙江臨安 311300；2. 浙江農林大學環境與資源學院，浙江臨安311300）

反硝化作用是土壤氮素循環過程中的重要一環，是指反硝化微生物在厭氧的條件下，通過一系列的酶催化還原反應，先將轉化為，然后再進一步轉化為氣態氮（NO，N2O，N2）的過程[1]。反硝化作用不僅會導致氮肥損失，造成嚴重的經濟危害。同時反硝化作用過程釋放的N2O 是三大溫室氣體之一，其產生的溫室效應約是CO2的300 倍[2]。此外，N2O 還會對臭氧層造成極大的破壞，增加皮膚癌的患病概率[3]。雖然硝化和反硝化過程均能產生N2O。但與硝化過程不同的是，N2O 是反硝化過程中的必要產物，甚至是終產物[4]，而且有大量研究表明亞熱帶酸性森林土壤中由反硝化作用產生的N2O 大于硝化作用[5]。雖然反硝化微生物主要分布在水體、沉積物和土壤等環境[6]，但由于土壤的環境更適合微生物生存，微生物多樣性更為豐富，而且土壤中氮含量普遍較水體、沉積物高，因此，研究土壤微生物反硝化作用對于減少氮肥損失，降低N2O 排放均有著重要的意義。

反硝化作用是一個由四步反應所構成的生物地球化學過程，包括還原、還原、NO 還原和N2O 還原。其每個步驟均由相應細菌的代謝合成酶催化完成。

毛竹林土壤屬于旱地土壤，雖然總體為好氧環境，但土壤中存在大小不等的孔隙，微小孔隙的局部環境也可能是厭氧的。故在此種土壤環境中也會有相應的反硝化過程存在。然而已有的大多數研究均圍繞著不同樹種森林[8]、沙漠[9]、草原[10]等其他生態系統展開。有關毛竹林反硝化過程微生物的變化情況少見報道。

毛竹是我國重要的經濟和生態竹種，具有生長周期短、產量高、經濟價值高等特點。為追求更高的經濟效益，人們對原來以粗放經營為主的毛竹林進行了集約化經營。集約經營的主要措施有施肥、去除林下植被、翻耕等。這種集約經營模式雖然提高了毛竹的產量，但人為耕作導致水土流失加劇，使土壤出現不同程度的退化[11]。與此同時，長期集約經營降低了土壤微生物的活性[12]，這也促使人們加大了對集約經營過程中土壤微生物相關生態變化的關注[13-15]。然而，與碳氮循環密切相關的反硝化微生物的研究少見報道。許多研究證明氮肥施用后因硝化作用產生大量N2O[16]，集約經營毛竹林土壤是否存在反硝化微生物？是否也會導致排放N2O 等問題值得探索。本文以nirK、nirS和nosZ3 個基因為研究對象，運用定量PCR 的方法初步探究集約經營過程中毛竹林土壤3 種功能基因豐度的變化，研究結果對毛竹林經營管理具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區遂昌縣位于浙江省西南部（28°13′—18°49′N，118°41′—119°30′E）。屬中亞熱帶季風類型，全年平均氣溫16.8 ℃，年降水量1 510 mm，降水天數172 d，年無霜期251 d。土壤母巖為由花崗巖變質而成的片麻巖石，土層厚度大于 1 m，坡度為20°～25°。毛竹密度約為 1 800 株·hm-2，1989 年之前為竹林開發階段，僅開墾、劈山，不施肥。該階段毛竹林下主要有 9 種植被，其中狗脊蕨（Woodwardia japonica） 和 兔 兒 傘 （Syneilesis aconitifolia）蓋度為 90%。1989—2000 年施肥方法為：大年（留養新竹年）6 月在每株毛竹的上方開環形溝，施用尿素（或碳銨）450 kg·hm-2；2000—2010 年施用配方肥，每年用量為尿素450 kg·hm-2、過磷酸鈣 380 kg·hm-2、氯化鉀 75 kg·hm-2；2010 年之后每年施用毛竹專用肥（福建中化生產）750 kg·hm-2和尿素 450 kg·hm-2。集約經營過程毛竹林下基本無灌木雜草，毛竹平均密度約3 250 株·hm-2。

1.2 樣品采集與處理

于2013 年9 月按照生態控制原則，選擇生長歷史一致但集約經營時間不同的毛竹林，采用隨機取樣法采集不同經營年限毛竹林表層（0～20 cm）和亞表層（20～40 cm）的土壤樣品。該毛竹林地均位于同一山頭，并由同一農戶經營，采取的施肥管理措施也均一致。集約經營的時間分別為：0 a（對照組）、10 a、15 a、20 a 和25 a。每個年份分別選擇3個樣地，即3 個重復，每個樣地采用S 型取樣法選取5 個樣品點就地混合為一個樣品，分別采集表層（0～20 cm）、亞表層（20～40 cm）的土樣，過篩（2 mm）后裝入密封袋，將樣品放入冰盒帶回實驗室。樣品共分為2 份，1 份放入-70℃冰箱，經冷凍干燥后，提取土壤細菌總DNA，用于分子生物學分析；另一份于室內自然風干，充分研磨過篩后用于土壤基本理化性質的測定。

1.3 分析方法

土壤理化性質分析：土壤理化性質分析方法參考《土壤農化分析》[17]。土壤pH 采用酸度計測定，土水比為 2.5︰1；有機碳含量采用重鉻酸鉀-濃硫酸油浴外加熱法測定；土壤全氮含量采用半微量凱式滴定法測定；堿解氮含量采用堿解擴散法測定；有效磷含量采用鹽酸-氟化銨溶液浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用醋酸銨提取，火焰光度計測定；硝態氮含量采用氯化鉀浸提，紫外分光光度計測定；銨態氮含量采用氯化鉀浸提，靛酚藍比色法測定。

土壤總 DNA 提取：采用 Power Soil DNA Isolation Kit 試劑盒提取土壤總DNA。稱取0.50 g 保存于-70 ℃冰箱，經冷凍干燥后，按試劑盒說明書進行提取。DNA 提取成功后經1%（m/v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 片段大小，并用微量分光光度計檢測其濃度和純度。提取后的DNA 樣品保存于-40℃。

土壤反硝化細菌質粒制備：以土壤樣品 DNA為模板分別對nirK、nirS、nosZ三種功能基因進行PCR 擴增，擴增條件如表1 所示。PCR 產物用純化試劑盒（Takara）純化后與PEASY-T3 Vector（全式金生物技術公司，北京）連接，然后將連接產物轉化到Trans1-T1 感受態細胞中，并涂在含有X-gal、IPTG 和 Amp 的 LB 瓊脂平板上進行藍白斑篩選，用菌落PCR 方法檢測陽性克隆子。對陽性克隆子用LB 液體培養基繼續培養，最后用質粒抽提試劑盒提取質粒。

表1 聚合酶鏈式反應中的引物及反應條件Table 1 Primers and PCR condition used for the PCR amplification

土壤反硝化細菌相關功能基因熒光定量PCR：采用引物 FlaCu：R3Cu、Cd3aF：R3cd、Lb：Rb 分別對nirK、nirS、nosZ三種功能基因進行基因片段擴增，定量 PCR 在熒光實時定量 PCR 儀（Bio-Red,USA）上進行。反應體系為 20 μL，反應體系如下：2×Premix Ex Taq 10 μL，50 μmoL·L-1上游和下游引物各0.2 μL，模板DNA1.0 μL，無菌雙蒸水8.6 μL。三種功能基因熒光定量PCR 條件相同，均為:95℃預變性3 min，95℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸 20 s，35 個循環，溶解曲線過程（65℃至95℃，0.5℃·5 s-1）。標準曲線制作：三種功能基因質粒 DNA 經 Nanodrop?ND-1000 測定，nirK、nirS和nosZ基因重組質粒濃度分別為105.6、102.5、135.2 ng·μL-1，計算其拷貝數分別為 2.74×1010、2.70×1010、3.74×1010copies·μL-1，以 10 倍梯度對重組質粒進行梯度稀釋（ 10-3～10-8），每個梯度3 次重復，nirK、nirS和nosZ決定系數（R2）分別為 0.995、0.998 和 0.999。

1.4 數據處理

采用 Microsoft Excel 2016 軟件對數據進行處理，采用Origin 7.5 軟件作圖，采用SPSS 21.0 軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差數（LSD）法進行顯著性和多重比較（α=0.05），采用皮爾遜（Pearson）法進行相關性分析。通過Canoco 4.5 結合環境因子分析微生物功能基因豐度的變化。

2 結 果

2.1 集約經營毛竹林土壤理化性質

有關毛竹集約經營土壤理化性質變化已有報道[15]。簡要概括：毛竹集約經營過程中土壤理化性質變化，表層土壤 pH 呈下降趨勢；有機碳、全氮含量于經營10 a 達到最大（P＜0.05），其余年份無顯著差異；堿解氮呈現先上升再下降后又上升的波動變化規律；碳氮比經營初期緩慢上升，15 a 時達到最大，20 a 顯著下降（P＜0.05）；有效磷和速效鉀總體呈上升趨勢；硝態氮出現先減少后增加的變化規律，而銨態氮在整個經營過程中變化不大。

與表層土壤不同的是，集約經營前期亞表層毛竹土壤pH 沒有發生明顯變化，而在第25 年時顯著下降 0.42 個 pH 單位（P＜0.05）；全氮和堿解氮均在經營25 a 之后顯著增加（P＜0.05）；有機碳含量在經營10 a 和25 a 顯著增加（P＜0.05），而在經營20 a 顯著下降（P＜0.05）。其余理化因子變化與表層相同。

2.2 集約經營對毛竹林土壤反硝化細菌功能基因豐度的影響

采用熒光實時定量PCR分析集約經營毛竹林土壤反硝化細菌豐度結果表明，nirK基因數量在2.62×107～1.28×108copies·g-1干土之間，隨著集約經營時間的持續，表層土壤nirK基因數量呈現周期性波動態勢（圖1A），上升過程發生在集約經營10 a和20 a 的2 個時間，其基因豐度顯著大于其他年份（P＜0.05），集約經營15 年時豐度達到最低值，顯著小于其他年份（P＜0.05），第 25 年時的基因豐度與對照組無顯著性差異。而亞表層土壤的nirK豐度變化呈V 字型，集約經營15 a 時才開始下降、20 a 時達到低谷，土壤nirK基因數量在15 a 和20 a 分別較對照下降43%和63%（P＜0.05），25 a 時又恢復至對照水平，集約經營10 a 和25 a 與對照無顯著性差異。nirS基因數量在 1.45×106～4.96×107copies·g-1干土之間，總體低于nirK基因。表層土壤基因數量在集約經營 10 a 顯著上升 41%（P＜0.05），之后一直保持較高的水平（圖 1B），說明集約經營促進表層土壤中攜帶nirS基因微生物的繁殖。土壤亞表層nirS基因數量則在前20 a 的集約經營過程中呈下降趨勢，第20 年最大下降幅度為63%，而第25 年則恢復到對照水平。nosZ基因數量在 3.81×107～3.03×108copies·g-1干土之間。表層土壤基因豐度在集約經營10 a 明顯增加，第15 年時開始下降，集約經營 20 a 較對照低 70%，之后則變化不大（P＞0.05）。亞表層土壤nosZ基因豐度前 10 年變化不大（圖1C），第15 年和20 年分別降低34%和48%，顯著低于對照和 10 a 土壤（P＜0.05），第 25 年時nosZ基因豐度恢復、且數量顯著高于對照（增加35%，P＜0.05）。集約經營過程中表層土壤的（nirK+nirS）/nosZ比率為 0.34～1.08，在亞表層為1.63～2.27。表層（nirK+nirS）/nosZ的比率在集約經營20 a 顯著增加，而亞表層中顯著降低。

圖1 長期集約經營毛竹林土壤反硝化細菌nirK、nirS、nosZ 功能基因豐度Fig. 1 Abundance of nirK，nirS，nosZ genes in the soils of the moso bamboo plantations under long-term intensive management

2.3 土壤理化性質對反硝化細菌功能基因豐度的影響

集約經營主要通過土壤性質的改變來影響土壤微生物。為揭示土壤性質對反硝化細菌豐度的影響，將表層與亞表層土壤的三個功能基因的豐度分別與對應的土壤理化性質進行相關性分析，結果如表 2所示。在表層土壤中，nirK基因數量與全氮呈顯著正相關（P＜0.05），nirS基因與有效磷呈顯著正相關（P＜0.05），而nosZ基因則與有機碳和碳氮比呈顯著正相關（P＜0.05）、與速效鉀和硝態氮含量呈顯著負相關（P＜0.05），說明影響表層土壤三個功能基因豐度的主要因素并不一致。作為 N2O 排放量指標[21]的（nirK+nirS）/nosZ比值與碳氮比呈顯著負相關（P＜0.05）、與速效鉀和硝態氮呈顯著正相關（P＜0.05）。在亞表層土壤中，三種功能基因均與有機碳呈顯著正相關（P＜0.05），nosZ基因還與全氮和堿解氮含量呈顯著正相關（P＜0.05）。（nirK+nirS）/nosZ的比值與硝態氮呈顯著負相關（P＜0.05）。

表2 毛竹林土壤反硝化功能基因與環境參數之間的皮爾遜相關系數Table 2 Pearson’s correlations（r）between denitrifying functional gene abundance and environmental parameters in the moso bamboo plantation

為了進一步揭示集約經營過程中土壤性質對反硝化功能基因豐度變化的影響，將表層以及亞表層土壤的反硝化功能基因豐度分別與對應土層的理化性質作為兩組變量進行冗余分析（RDA，Redundancy analysis）。根據蒙特卡洛檢驗，選取影響較大的 4個環境因子分析結果表明，表層土壤中第一排序軸和第二排序軸分別解釋了 25.8%和 23.6%的變異（圖 2A），第一排序軸將 CK 和10 年樣品與20 年和25 年樣品很好地區分開來，而 15 年樣品則在第二坐標軸附近，說明集約經營過程中土壤反硝化功能基因豐度變化分為三個階段。第一排序軸與碳氮比呈正相關、與硝態氮和速效鉀呈負相關，第二排序軸與全氮呈負相關。土壤硝態氮（F=3.855，P=0.024）、碳氮比（F=3.832，P=0.022）、速效鉀（F=2.844，P=0.050）對土壤反硝化細菌功能基因豐度的影響均達顯著水平，而全氮（F=2.646，P=0.054）則接近顯著水平。進一步分析可得，硝態氮和速效鉀對 20 年和 25 年樣地反硝化細菌影響最大。nirK與全氮呈顯著正相關，nosZ與硝態氮和速效鉀呈顯著負相關，這與相關性分析結果相同。

圖2 集約經營毛竹林土壤反硝化功能基因豐度與環境參數的冗余分析Fig. 2 Redundancy analysis of abundance of denitrifying functional genes and environmental parameters in soils of the moso bamboo plantation under intensive management

根據蒙特卡洛檢驗，選取亞表層土壤中影響較大的4 個環境因子分析結果表明，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了66%和1.7%的變異，第一排序軸上三個功能基因與有機碳相關性很強（圖 2B）。不同集約經營時間的土壤均聚焦在一起（一個對照重復外），但分組情況與表層土壤不同，15 年和20年聚在一組、位于第一排序軸正值區，其他3 個年份組位于第一排序軸的負值區，且25 年又與CK 和10 年在第二排序軸分開。說明集約經營時間對3 個反硝化功能基因影響顯著，其中影響最大是有機碳和銨態氮，與第一排序軸呈負相關，有機碳（F=14.717，P=0.002）達到顯著水平，而銨態氮（F=2.795，P=0.092）則沒有；其次為堿解氮和碳氮比，分別與第二排序軸呈正相關和負相關，但均未達到顯著水平（堿解氮 F=2.315，P=0.114、碳氮比F=1.811，P=0.181）。進一步分析發現，堿解氮對集約經營25 年樣地有積極影響，有機質與3 種功能基因均呈顯著正相關，全氮和堿解氮與nosZ功能基因呈正相關。

3 討 論

前人的研究結果證明，影響土壤反硝化作用的因素比較多，而且各因素之間互為影響，主要影響因子包括速效氮、有機碳、土壤水分、溫度、pH 以及土壤質地等[22]。理論推測以及研究證明，單因素的速效氮[23]、有機碳[24]、土壤水分[23]、溫度[25]、pH[26]與反硝化作用均有正相關關系，而自然或人為耕作土壤的土壤性質變化不一致（不同步），因此，實際測量得到的反硝化基因豐度變化是多個因素綜合作用的結果。由于不同因素的作用強度不同，正反作用可能會抵消、或者作用強的因子將弱的因子掩蓋掉。

3.1 集約經營對毛竹林表層和亞表層反硝化基因的總體影響

毛竹林土壤的反硝化基因nirK、nirS和nosZ豐度總體較報道的結果高（圖1），除旱地農田nirS外，水稻田、杉木林和旱地農田中的三種功能基因豐度均顯著低于毛竹林或與毛竹林持平[27-29]。這表明毛竹林土壤含有更高的反硝化基因豐度，因此相比其他土地利用方式可能N2O 排放量較高。集約經營措施主要措施有施肥、去除林下植被、翻耕等。由此，集約經營過程中土壤速效養分水平提高，土壤通氣性增加，pH 下降，有機碳含量不斷波動。其中 pH下降的原因在于集約經營過程中大量氮肥的施用，而有機碳含量不斷變化的原因在于一方面集約經營初期施肥結合翻耕促進土壤中地下根鞭的分解，另一方面施肥促進毛竹生長，增加毛竹根系分泌物量，從而提高了土壤的有機質含量。而10 年后不斷翻耕施肥導致有機碳含量下降。25 年有機質又有小幅回升，這可能與毛竹生產量提高后，枯落物和根系分泌物的增加有關。隨著集約經營時間的增加，三種反硝化基因的變化表現出一定的規律性，無論是表層還是亞表層土壤，三種功能基因豐度在集約經營10 年時增加或保持不變，說明在前 10 年期間毛竹林集約經營措施對反硝化細菌沒有產生不良影響，有的還有促進作用。盡管有研究表明酸性范圍內土壤 pH 越低，反硝化細菌豐度也會隨之降低[26]。而在本研究中有機碳、全氮和堿解氮明顯增加對反硝化作用的正作用抵消了 pH 下降的負面影響，從而掩蓋了 pH 下降帶來的不利影響。土壤硝態氮下降是反硝化作用增強導致底物減少的結果（表1）。這與斐自偉等[30]的研究結果相似。除表層土壤nirS基因外，三種功能基因在集約經營過程的某一階段出現不同程度的下降，但集約經營持續25 年時，除了nosZ表層功能基因外，其他反硝化功能基因豐度均恢復到對照甚至超過對照的水平（圖1）。10 年之后土壤有機碳及pH 明顯低于對照和10 年土壤，這可能是導致反硝化基因豐度下降的主要原因。而在25年反硝化基因豐度回升可能是由于有機碳含量的上升。由于土壤因子變化較復雜，將土壤性質與基因豐度進行相關性和冗余分析以揭示內在規律，相關分析表明，nirK和nirS基因豐度與不同土層土壤性質的相關性沒有一致的規律，而nosZ基因豐度在表層和亞表層均與有機碳顯著相關。表層和亞表層土壤pH 和銨態氮與所有基因均沒有顯著相關性（表2），其他指標則分別或同時與某一土層的某個基因表現出顯著相關性，其中單因子有機碳、全氮以及它們的比值（C/N）與反硝化基因相關的頻率最高。冗余分析表明，表層土壤的硝態氮、C/N、速效鉀以及全氮含量等4 個因子對3 個反硝化基因影響的顯著水平依次遞減，而對亞表層影響較大的4 個因子依次為：有機碳、銨態氮、堿解氮以及 C/N，不同土層驅動基因豐度變化的主要土壤性質不同，而C/N 同時影響兩個土層，且兩個土層分別同時出現2 個含氮指標，說明集約經營措施主要通過土壤氮和有機碳綜合影響反硝化微生物的活動和功能。由于所有土壤的質地相同，集約經營措施是每年去除林下植被、翻耕，故不同集約經營時間的土壤疏松度差別不大，因此，土壤化學性質變化是影響基因豐度的主要因素。

3.2 集約經營過程中表層和亞表層反硝化基因的差異

為弄清土層深度對不同反硝化基因的影響，我們對不同土層之間各種基因豐度差異情況展開討論。表層nirS和nosZ土壤基因豐度顯著高于亞表層土壤，但nirK基因豐度出現相反現象。大部分研究報道表層土壤反硝化基因豐度高于亞表層土壤，nirK、nirS和nosZ豐度在不同類型土壤如耕地[31]、草地[32]和森林[33]中均隨著深度的增加而降低。雖然亞表層土壤的氧化還原電位通常較表層低，有利于反硝化作用，但表層土壤有機碳高于亞表層，可能對反硝化作用的影響更大。為什么亞表層土壤的nirK基因豐度反而高于表層的異常現象？從前面分析得知，毛竹林集約經營土壤反硝化細菌豐度變化受到氮素水平和有機碳的影響最大，而亞表層土壤的氮素水平和有機碳均低于正常表層，從土壤性質解釋不通。推測可能是分布在30 cm 亞表層的毛竹竹鞭分泌大量可溶性有機碳，對攜帶nirK基因的微生物促進效果較nirS和nosZ基因微生物更加顯著。李振高等[34]也發現在小麥生長過程中隨著根系分泌物的增加反硝化細菌數量不僅顯著增加，同時根系分泌物還刺激了反硝化細菌的代謝活動。此外，研究證明pH 與nirK反硝化基因豐度呈顯著正相關[26]，而在本研究中表層pH 顯著低于亞表層，因此pH 也可能是導致nirK表層和亞表層豐度出現異常的原因之一。

3.3 集約經營過程中不同反硝化基因之間的差異

本研究中，反硝化基因nirK、nirS和nosZ等隨著集約經營時間的變化規律不同。盡管表層土壤中nirK和nirS兩種功能基因共同編碼亞硝酸還原酶，且豐度上有著相同的數量級，但毛竹集約經營過程中兩種nir基因變化趨勢不同，且分別受不同的土壤理化因子的控制。關于這兩種基因的同步[35]和反向[36]變化規律的結果均有報道。由于土壤中攜帶反硝化nirK和nirS的微生物屬于不同的種[7]，在環境中有各自的生態位[27]，對同一環境因子的響應可能不同。有時可能存在競爭關系[36]、有時候存在正相關關系[35]，有時則互不影響[26]，三種關系均有可能發生。毛竹林表層土壤中nirK和nirS無顯著相關性，屬于互不影響的關系，這可能是因為nirK豐度在整個集約過程中的波動遠大于nirS。研究表明nirK對環境的敏感程度要遠大于nirS[37]。而集約經營過程中由于施肥、毛竹凋落物、翻耕等抗干擾活動導致微生物的生境不斷變化，可以很好地解釋nirK基因豐度波動大于nirS的結果。與nirK和nirS變化規律不同，集約經營過程中表層和亞表層土壤的nosZ基因豐度均表現為先增加后減少的一致規律，且與有機碳含量呈顯著正相關；表層土壤nosZ豐度與速效鉀和硝態氮含量呈顯著負相關、而亞表層土壤nosZ豐度則與碳氮比呈顯著正相關，說明有機碳是影響nosZ豐度的共性因子，研究表明[38]隨著氮肥施用量增加，土壤碳氮比降低，土壤中反硝化微生物nosZ的豐度顯著降低。毛竹林在集約經營初期由于施肥促進有機質分解以及促進毛竹生長使毛竹分泌根系分泌物增加，因而，土壤有機質含量明顯增加，雖然施肥增加土壤氮水平，但增幅小于有機碳，因此，土壤碳氮比總體升高有利于攜帶nosZ基因的微生物活動。而長期集約經營碳氮比顯著低于對照，nosZ基因豐度同碳氮比一樣呈現同步變化的趨勢。

3.4 集約經營過程中（nirK+nirS）/nosZ 比值變化

研究發現（nirK+nirS）/nosZ比值可預測 N2O排放的變化，相同基因豐度水平情況下比值越高產生的 N2O 越多[21]。表層土壤（nirK+nirS）/nosZ比值在集約經營初期變幅不大，而在集約經營后期顯著上升（圖 1D），說明隨著集約經營時間可能會增加N2O 排放。表層后期nosZ基因降幅較大（圖1C）而nirS基因則沒有下降（圖 1B），因此造成（nirK+nirS）/nosZ比值明顯增加。集約經營后期硝態氮明顯積累，為反硝化作用提供豐富的底物，反硝過程可以保持在較高水平，而nosZ基因數量顯著減少使硝化過程不能徹底還原為N2，導致N2O 排放量增加。nosZ基因數量減少主要受到與硝態氮積累有關，研究表明[23]高濃度的硝態氮會抑制N2O 還原酶（nosZ）的活性，使 N2O 轉化為 N2速率減慢。亞表層土壤由于nirK明顯高于表層、而nosZ則明顯低于表層，導致（nirK+nirS）/nosZ比值顯著高于表層（圖 1D），但隨著集約經營時間呈緩慢下降趨勢。從3 個基因豐度變化情況看，亞表層土壤對nosZ基因的影響大于（nirK+nirS），說明亞表層土壤反硝化步驟主要為還原形成NO，因而產生較多的N2O。然而，亞表層土壤（nirK+nirS）/nosZ的比值在集約經營后期顯著降低，這正好與表層的變化規律相反、呈顯著負相關。亞表層土壤（nirK+nirS）/nosZ與硝態氮濃度呈顯著負相關，這可能是由于土壤亞表層相比表層硝態氮濃度更低，故在集約經營后期并未抑制N2O 還原酶活性。以上結果推測，整個集約經營過程亞表層土壤反硝化產生的N2O 均高于表層，表層土壤集約經營后期N2O 排放量增加。

4 結 論

反硝化作用是竹林土壤氮循環的重要一環。隨著集約經營時間的增加，兩層土壤的三種功能基因豐度在集約經營 10 年時表現增加或不變的一致規律。除表層土壤nirS基因外，三種功能基因在集約經營過程的某一階段（15 或 20 年）出現不同程度的下降，集約經營持續25 年時，除nosZ表層土壤基因豐度仍低于對照，其他不同土層土壤基因豐度均恢復甚至超過對照水平，說明土壤反硝化細菌表現出對集約經營干擾的抵抗和恢復反應。集約經營措施主要通過土壤氮和有機碳變化綜合影響反硝化細菌的活動和功能。毛竹林集約經營土壤的反硝化細菌積極參與氮循環過程，加劇N2O 溫室氣體的排放。建議在集約經營過程中，通過施用緩釋肥料以減少反硝化細菌的底物硝酸根。