長鏈非編碼RNA CASC9靶向miR-195-5p對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的影響

陳志文 胡曉偉 樊勝杰

1湖北省襄陽市中西醫結合醫院普外科，襄陽 441004；2湖北省谷城縣人民醫院普外科，谷城 441700

近年來隨著測序技術和相關領域基因學的迅速發展，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的生物學功能逐漸受到重視。研究表明lncRNA 在生物體內生物學功能廣泛，尤其在基因轉錄后、細胞周期和分化等多個層面調控基因的表達[1]。lncRNA腫瘤易感性候選基因9 (cancer susceptibility candidate 9，CASC9)在食管鱗癌和肝癌中的表達明顯升高，發揮著重要的促癌作用[2-3]。微小RNA-195-5p(miR-195-5p)是一類抑癌基因，生物信息數據庫檢索發現miR-195-5p是CASC9下游靶點之一[4]，在骨肉瘤、肝癌、舌鱗癌等癌細胞中呈低表達狀態[5-6]。但目前有關 CASC9與miR-195-5p在胰腺癌中的作用機制尚不清楚。本研究檢測 CASC9在胰腺癌組織和細胞中的表達水平，分析 CASC9及其靶基因miR-195-5p對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的作用，以期為胰腺癌治療提供新的理論依據。

資料與方法

一、胰腺癌組織、細胞株CASC9和miR-195-5p表達檢測及兩者相關性分析

選取2017年4月至2018年5月間湖北省襄陽市中西醫結合醫院行手術切除并經組織病理學證實的40例胰腺癌患者的癌組織及相應癌旁正常胰腺組織(距離手術切緣>3 cm)。術前患者均未接受化療、放療等輔助治療。所有標本取下后立即放入-196℃液氮中保存。

應用Trizol法抽提胰腺癌組織及癌旁組織總RNA，RNA逆轉錄與擴增按試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書操作，轉錄的cDNA再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(TliRnaseH Plus，日本TaKaRa公司)行實時熒光定量PCR反應。 CASC9正向引物序列5′-AGATGAAGCCGGTACCTCAGAT-3′，反向引物序列5′-TCACTTTAAAGAGGGAGAGGAG-3′；內參GAPDH正向引物序列5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，反向引物序列5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′；U6正向引物序列5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。通過儀器自帶軟件獲取擴增產物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt計算各基因相對表達量，每個樣品設3個復管，取均值。

正常胰腺導管上皮細胞株HPDE6-C7及胰腺癌細胞株AsPC-1、HPAC、BxPC-3、PANC1均由中國科學院細胞庫提供，常規復蘇、傳代。取對數生長期細胞，采用上述相同方法檢測細胞CASC9表達量。

采用上述方法檢測20例胰腺癌組織miR-195-5p表達量。miR-195-5p正向引物序列5′-GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，反向引物序列5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。分析胰腺癌組織miR-195-5p與CASC9表達水平的相關性。

二、胰腺癌BxPC-3細胞分組及檢測

1．BxPC-3細胞分組：將BxPC-3細胞分為si-CASC9組(轉染靶向lncRNA CASC9的siRNA)、si-control組(轉染與CASC9不匹配的siRNA)、CACS9組(轉染CASC9過表達質粒)和CASC9/miR-195-5p組(共轉染CASC9過表達質粒和miR-195-5p mimics)。所有siRNA、質粒及miR-195-5p mimics均由上海Gene Pharma公司設計、合成。使用脂質體2000試劑(Thermo Fisher Science，美國)進行細胞轉染，按照說明書操作。運用Geneticin(Sigma-Aldrich,美國)篩選出穩定轉染的細胞株。

2．BxPC-3細胞增殖活性檢測：選用3～6代si-control組、si-CASC9組、CACS9組、CASC9/miR-195-5p組BxPC-3細胞，以每孔1×104個細胞均勻接種于96孔板，分別培養1、2、3、4 d，到時間點時每孔加入5 mg/ml MTT(武漢博士德生物科技有限公司)20 μl，繼續孵育4 h，每孔再加入150 μl DMSO，室溫搖床振蕩10 min，上酶標儀在490 nm處測定每孔的吸光度值(A490值)，繪制細胞生長曲線。

3．BxPC-3細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2檢測：收集si-control組、si-CASC9組、CACS9組、CASC9/miR-195-5p組BxPC-3細胞，加入蛋白裂解液(Roche,美國)抽提總蛋白，應用BCA法定量后常規行蛋白質免疫印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達，以GAPDH為內參。抗Bax抗體(ab32503，1∶1 000)和抗Bcl抗體(ab32124,1∶1 000)均購自英國Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)購自武漢博士德生物科技有限公司。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件分析，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、lncRNA CASC9與miR-195-5p的關系驗證

從Starbase數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)搜索CASC9的潛在靶向基因，通過熒光素酶報告基因法驗證lncRNA CASC9和miR-195-5p之間的靶向關系。將擴增的野生型(wild type, WT)lncRNA CASC9序列插入pmirGLO dual-luciferase miRNA target expression vector (Promega Corp，美國)，構建WT熒光報告載體pmirGLO-WT-CASC9。使用GeneArtTMSite-Directed Mutagenesis PLUS System(A14604, Thermo Fisher Scientific Inc.美國)推定突變lncRNA CASC9與miR-195-5p的結合位點，將突變體(mutant type, MT)lncRNA CASC9片段插入pmirGLO載體，構建MT熒光報告載體pmirGLO-MT-CASC9。將2個報告載體分別和miR-195-5p mimics或陰性對照mimics(mimics-NC)共轉染BxPC-3細胞(分別設為WT-CASC9/miR-195-5p組、MT-CASC9/miR-195-5p組和WT-CASC9/mimics-NC組、MT-CASC9/mimics-NC組)，48 h后按照試劑盒說明書測定熒光素酶活性。實驗重復3次。

四、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織和各細胞株lncRNA CASC9表達量

胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA CASC9表達量分別為4.70±1.25、2.15±0.82，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(t= 2.95，P=0.04)。HPDE6-C7、AsPC-1、HPAC、BxPC-3、PANC1細胞株中lncRNA CASC9表達量分別為1.00±0.10、1.43±0.12、1.86±0.13、2.03±0.14、1.73±0.15，胰腺癌細胞株均顯著高于HPDE6-C7細胞，差異均有統計學意義(t值分別為4.77、9.08、10.37、7.01，P值均<0.001)。其中以BxPC-3細胞CASC9的表達量最高，故實驗均采用BxPC-3細胞。

二、抑制BxPC-3細胞lncRNA CASC9表達可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡

si-CASC9組lncRNA CASC9表達水平顯著低于si-control組(0.26±0.026比1.00±0.06，t=19.56，P< 0.001)，表明抑制lncRNA CASC9表達的BxPC-3細胞株構建成功。

si-control組和si-CASC9組細胞的生長曲線見圖1A。培養第3、4天的si-CASC9組細胞較si-control組細胞的增殖活性顯著下降(0.57±0.05比0.72±0.04，t=4.05，P=0.01；0.75±0.07比0.95±0.07，t=3.49，P=0.02)，差異有統計學意義，提示抑制lncRNA CASC9表達可抑制BxPC-3細胞增殖。si-control組、si-CASC9組Bax 表達水平分別為1.07±0.11、1.39±0.13，Bcl-2表達水平分別為1.71±0.12、1.44±0.11，表明抑制lncRNA CASC9表達可顯著上調Bax(t=3.26，P=0.03)、下調Bcl-2表達水平(t=2.85，P=0.04)，提示抑制lncRNA CASC9表達可促進BxPC-3細胞凋亡(圖1B)。

三、lncRNA CASC9與miR-195-5p的靶向關系確定

來自Starbase數據庫下載圖所示，CASC9包含miR-195-5p的保守目標位點(圖2A)。20例胰腺癌組織lncRNA CASC9和miR-195-5p表達量見圖2B，計算出lncRNA CASC9和miR-195-5p之間的相關性系數R2=0.549，證實lncRNA CASC9與miR-195-5p表達之間存在負向調節的關系。雙熒光素酶報告法檢測結果顯示，WT-CASC9/miR-195-5p組、WT-CASC9/mimics-NC組、MT-CASC9/miR-195-5p組、MT-CASC9/mimics-NC組的熒光素酶活性分別為0.37±0.03、1.00±0.08、0.96±0.06、1.00±0.08，WT-CASC9/miR-195-5p組較MT-CASC9/miR-195-5p組顯著下降(t=12.77，P<0.001)，而WT-CASC9/mimics-NC組與MT-CASC9/mimics-NC組間的差異無統計學意義(t=0.75，P=0.49)，證實lncRNA CASC9和miR-195-5p之間可以靶向結合。

四、miR-195-5p逆轉CASC9促進胰腺癌細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用

CASC9/miR-195-5p組中miR-195-5p mimics轉染對BxPC-3細胞CASC9的表達無顯著影響(2.45比2.33，t=1.44，P>0.05)，只是增加了細胞miR-195-5p的表達(0.37比0.88，t=13.97，P<0.001)。MTT實驗結果顯示，第2、3、4天時si-control組A490值分別為0.26±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02，CASC9組分別為0.34±0.02、0.57±0.03、0.71±0.03，CASC9/miR-195-5p組分別為0.29±0.02、0.45±0.02、0.59±0.03。CASC9組細胞增殖活性較si-control組顯著增加(t=4.90、9.61、14.89，P值均<0.05)，而CASC9/miR-195-5p組細胞增殖活性較CASC9組顯著下降(t=3.06、5.77、4.90，P值均<0.05)，提示lncRNA CASC9促進BxPC-3胰腺癌細胞增殖的作用被miR-195-5p逆轉。蛋白質免疫印跡法結果顯示， CASC9組Bax表達水平顯著低于CASC9/miR-195-5p組(0.56±0.03比0.68±0.04，t=4.16，P=0.01)，Bcl-2表達顯著高于CASC9/miR-195-5p組(1.47±0.04比1.05±0.03，t=14.55，P<0.001(圖3)，提示lncRNA CASC9抑制BxPC-3細胞凋亡的作用被miR-195-5p逆轉。

圖1 si-control組和si-CASC9組BxPC-3細胞的生長曲線(1A)及Bax(1)和Bcl-2(2)蛋白的表達(1B)

圖2 CASC9與miR-195-5p結合位點(2A)及胰腺癌組織CASC9與miR-195-5p表達關系(2B)

圖3 si-control組(1)、CASC9組(2)、CASC9/miR-195-5p組(3)BxPC-3細胞及Bax、Bcl-2蛋白表達

研究顯示非編碼RNA在腫瘤的發生和發展中扮演著重要的角色[7-9]，其中lncRNAs生物學功能包括參與表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控、miRNA調控、細胞分化及發育，其重要機制之一是通過對周圍的相關編碼基因的選擇性表達發揮調控作用[10]。例如lncRNA CASC9在食管癌中的表達明顯升高，抑制其表達能抑制食管癌細胞的發生和發展[11]。此外，有研究表明lncRNA CASC9可顯著抑制鼻咽癌和肝癌的惡性表型[2-13]。這些研究提示可通過在表達水平上具有顯著性差異的lncRNA來尋找包括胰腺癌在內的多種疾病診斷及治療的分子標志物。本研究首次證明胰腺癌組織和細胞系lncRNA CASC9表達顯著上調，抑制其表達能抑制胰腺癌細胞增殖，促進胰腺癌細胞凋亡，提示CASC9是一種促癌的lncRNA，在胰腺癌進展中起著關鍵作用。

miRNAs是內源性的小非編碼RNA，但與功能基因的表達密切相關[14]。miR-195-5p在許多腫瘤中表達下調，比如舌鱗狀細胞癌[15]和膀胱腫瘤[16]，目前被認為是一個抑癌的miRNA。最近研究發現lncRNAs通過作為miRNAs的競爭性內源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)發揮作用。有研究表明，下調miR-196-5p的表達可促進原發性腹膜癌的腫瘤進展和維持腫瘤干細胞特征[17]。也有研究表明，miR-195-5p通過靶向子宮內膜癌中lncRNA PVT1發揮促癌作用[23]。受ceRNA調節網絡的啟發，本課題組假設lncRNA CASC9也可能是一種ceRNA。通過生物學信息和雙熒光素酶分析證實lncRNA CASC9能特異性結合miR-195-5p，功能性實驗表明CASC9與miR-195-5p的表達呈負相關，且miR-195-5p能逆轉CASC9促進胰腺癌惡性表型的效應，從而證明了CASC9可能作為胰腺癌細胞miR-195-5p的競爭性內源RNA發揮作用。

綜上所述，本研究通過臨床樣本和體外細胞實驗證實，miR-195-5p通過靶向結合lncRNA CASC9可逆轉CASC9促胰腺癌細胞增殖和抑制胰腺癌細胞凋亡的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突