長鏈非編碼RNA XIST 靶向miR-101/EZH2對胰腺癌細胞增殖和遷移的影響

閔捷 曹麗莉 沈彬彬 周瑜 黎亮 周俊

1浙江省嘉興市第一醫院(嘉興學院附屬第一醫院)肝膽外科，嘉興 314000；2浙江省榮軍醫院外科，嘉興 314000

非編碼RNA包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和微小RNA (micro RNA，miR)，這兩種RNA通過不同的分子機制相互作用參與腫瘤的發生[1]。研究證實，lncRNA X染色體失活特異轉錄本(X-inactive specific transcript，XIST)作為癌基因，在肺腺癌、非小細胞肺癌、結腸癌和膠質瘤組織中高表達，促進腫瘤的發生、發展和轉移[2-6]，而miR-101則作為抑癌基因在胰腺癌組織中呈低表達，可通過靶向抑制Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶2(rhoassociated coiled coil forming protein kinas，ROCK2)減弱胰腺癌細胞的侵襲能力[7]。zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog2, EZH2)是miR-101的下游靶向基因，與miR-101的結合靶點為3′-UTR區，其存在7個互補堿基。既往研究報道[8]，lncRNA XIST和miR-101在宮頸癌中的表達呈負相關，認為lncRNA XIST可通過海綿樣吸附作用，競爭性與miR-101結合，抑制miR-101的調控作用。然而有關lncRNA XIST與miR-101兩者相互作用對胰腺癌的影響報道較少。本研究旨在探討lncRNA XIST與miR-101/EZH2對胰腺癌細胞增殖、遷移的影響及其與臨床病理特征的關系，以期為胰腺癌的早期診斷和治療靶點提供參考。

資料與方法

一、臨床標本及lncRNA XIST、miRNA-101表達量檢測

收集2010年7月至2018年9月間浙江省嘉興市第一醫院肝膽胰外科手術切除且病理確診的90例胰腺癌患者的癌組織和匹配的癌旁正常胰腺組織(距離手術切緣>3 cm)，其中男性54例，女性36例，年齡38～69歲，中位年齡48歲。胰頭癌58例，胰體尾癌32例；高分化30例，中分化39例，低分化21例；直徑<2 cm 32例，>2 cm 58例；腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ期39例、Ⅲ+Ⅳ期51例；淋巴結轉移28例，未轉移62例。術前患者均未接受化療、放療等輔助治療。所有標本取下后立即置-196℃液氮中保存。

應用Trizol抽提胰腺癌組織和癌旁組織RNA，應用實時定量RT-PCR方法檢測lncRNA XIST及miR-101的表達量，RNA逆轉錄按試劑盒說明書操作，逆轉錄的cDNA行實時熒光定量PCR。反應條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，40個循環；溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。XIST正向引物序列5′-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3′，反向引物序列5′-CAAGGGGAATGAACACGAGG-3′；miR-101正向引物序列5′-CGGCGGGGAGAAATTATCCT-3′，反向引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6正向引物序列5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物序列5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴增產物的Ct值，采用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。每個樣品設3個復管，取均值。

二、胰腺癌PANC1細胞培養及分組

PANC1細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心，常規復蘇、傳代。取對數生長期細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板。將PANC1細胞分為lncRNA XIST表達抑制組(sh-XIST組)、shRNA對照組(sh-control組)、miR-101過表達組(miR-101組)和空質粒對照組(miR-control組)，分別感染plko-lncRNA XIST-shRNA、plko-control-shRNA、plko-control miR和plko-miR-101慢病毒。所有慢病毒的質粒載體由本課題組自行構建，再由上海捷瑞生物有限公司進行病毒包裝，病毒∶細胞為100∶1。感染細胞24 h后更換培養基，用含1 μg/ml嘌呤霉素的DMEM培養液處理細胞24 h以殺死未被感染的細胞，取存活并感染成功的細胞進行培養及傳代。取對數生長期細胞，采用上述實時熒光定量PCR法檢測各組PANC1細胞lncRNA XIST和miR-101表達水平。

三、PANC1細胞增殖活性檢測

取sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組第3代PANC1細胞，以每孔5×104個細胞接種于96孔板，分別培養0、12、48、72 h，到時間點時每孔加入20 μl CCK-8(日本株式會社)繼續孵育2 h，上酶標儀在波長450 nm處測定每孔吸光度值(A450值)，繪制細胞生長曲線。

四、PANC1細胞遷移能力檢測

選用sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組第3代PANC1細胞，用無血清培養液調整為1×106/ml個細胞懸液，在Transwell小室(美國Corning公司)的上室加入100 μl細胞溶液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液500 μl，培養24 h后取出小室隔膜，用棉簽輕輕擦去隔膜上室面未穿膜細胞，用4%多聚甲醛室溫固定隔膜30 min，PBS洗滌3次，1%結晶紫染液染色15 min，自來水洗滌多余的結晶紫染液，室溫干燥，在顯微鏡下觀察穿膜細胞數。

五、PANC1細胞EZH2蛋白表達檢測

收集sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組對數生長期PANC1細胞，采用RIPA細胞裂解液裂解組織，抽取總蛋白。采用BCA試劑盒定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測EZH2表達水平，以Tubulin為內參。EZH2單克隆抗體和HRP標記羊抗小鼠二抗均購自美國Santa Cruz公司，EZH2工作濃度為1∶2 000，二抗工作濃度為1∶2 500。采用ECL發光，X片曝光、顯影、定影。應用Bio-Rad公司的全自動凝膠成像系統掃描蛋白條帶，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

六、PANC1細胞裸鼠種植瘤實驗

將sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組PANC1細胞經胰酶消化后，以3×106個/100 μl密度分別接種于Balb/c裸鼠(20 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司)腋下脂肪墊，100 μl/只。在SPF級動物房中飼養小鼠，每隔2 d測量腫瘤長徑和寬徑，采用體積[V(mm3)]=1/2×長(mm)×寬(mm)×寬(mm)計算腫瘤體積。

七、lncRNA XIST與miR-101的關系驗證

生物信息學研究顯示lncRNA XIST和miR-101存在7個互補的堿基，miR-101與EZH23′UTR區域存在7個互補堿基[8]，依據miR-101與它們的結合位點，設計野生型lncRNA XIST(XIST-WT)和野生型EZH2-3′-UTR(EZH2-WT)以及缺失miR-101結合區域的lncRNA XIST突變體(XIST-Mut)和EZH2-3′-UTR突變體(EZH2-Mut)序列，并構建熒光素酶報告載體(山東維真生物有限公司構建)。分別將XIST-WT、XIST-Mut、EZH2-WT、EZH2-Mut熒光素酶報告載體轉染miR-101-control組及miR-101組PANC1細胞48 h，采用雙熒光素酶報告基因試劑盒(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性。

八、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織和各組PANC1細胞lncRNA XIST和miR-101表達水平

胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA XIST表達量分別為2.89±0.42和1.12±0.22，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(t=3.948，P<0.05)。胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織miR-101表達量分別為0.32±0.12和1.25±0.22，癌組織顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(t=3.118，P<0.05)。sh-XIST組PANC1細胞lncRNA XIST表達水平較sh-control組顯著下調(0.34±0.18比1.21±0.27)，miR-101組PANC1細胞miR-101表達水平較miR-control組顯著上調(2.94±0.31比1.54±0.29)，差異均有統計學意義(t值分別為3.801、3.710，P值均<0.05)。

二、胰腺癌組織lncRNA XIST和miR-101表達水平與腫瘤病理特征的關系

胰腺癌組織lncRNA XIST、 miR-101表達水平與腫瘤的分化程度、臨床分期和淋巴結轉移顯著相關，即胰腺癌的分化程度越高、TNM分期越高、淋巴結轉移的癌組織lncRNA XIST水平顯著升高，miR-101水平顯著降低，而它們與病理類型和腫瘤大小無明顯相關性(表1)。

表1 胰腺癌組織lncRNA XIST和miR-101表達水平與腫瘤病理特征的關系

注：lncRNA XIST為長鏈非編碼RNA X染色體失活特異轉錄本

三、lncRNA XIST和miR-101對PANC1細胞增殖和遷移能力的影響

sh-control組、sh-XIST組、miR-control組和miR-101組PANC1細胞的生長曲線見圖1，sh-control組和sh-XIST組48 h時A450值分別為1.45±0.21、0.89±0.15；72 h時分別為1.98±0.24、1.21±0.20，sh-XIST組較sh-control組的細胞增殖能力明顯下降(t值分別為3.148、3.290)； miR-control和miR-101組48 h時A450值分別為1.39±0.18、0.81±0.19；72 h分別為1.87±0.21、1.11±0.17，miR-101組較miR-control組的細胞增殖能力顯著下降(t值分別為3.206、3.409)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

sh-control組、sh-XIST組、miR-control組和miR-101組細胞遷移數量分別為(74.25±6.79)、(29.11±5.17)、(61.27±5.19)、(20.47±4.58)個細胞/200倍視野(圖2)， sh-XIST組較sh-control組、miR-101組較miR-control組穿膜細胞數量均顯著下降，差異均有統計學意義(t值分別為4.119、4.387，P值均<0.05)。

四、lncRNA XIST和miR-101對各組裸鼠種植瘤生長影響

sh-XIST組較sh-control組、miR-101組較miR-control組裸鼠種植瘤體積均明顯縮小，差異有統計學意義(F值分別為2.910、2.971，P值均<0.05，圖3)。

五、lncRNA XIST和miR-101及EZH2 3′UTR區域靶向關系確定

轉染XIST-WT的miR-101組PANC1細胞的熒光素酶活性較轉染 XIST-WT的miR-control組細胞顯著下調(0.35±0.15比1.23±0.25，t=3.098，P<0.05)；轉染XIST-Mut的 miR-control組和miR-101組PANC1細胞的熒光素酶活性分別為1.10±0.15和0.99±0.17，差異無統計學意義(t=0.275，P>0.05)，證明miR-101是lncRNA XIST的結合靶點(圖4)。

圖1 sh-control組、sh-XIST組(1A)與miR-control組、miR-101組(1B)PANC1細胞的生長曲線

圖2 sh-control組(2A)、sh-XIST組(2B)、miR-control組(2C)和miR-101組(2D)PANC1穿膜細胞(結晶紫染色 ×200)

圖3 sh-control組、sh-XIST組(3A)與miR-control組、miR-101組(3B)裸鼠種植瘤體積

圖4 lncRNA XIST和miR-101的靶向關系

轉染EZH2-WT的miR-101組PANC1細胞的熒光素酶活性較轉染 EZH2-WT的miR-control組細胞顯著下調(0.39±0.12比0.94±0.15，t=3.001,P<0.05)；轉染EZH2-Mut的miR-control組和miR-101組PANC1細胞的熒光素酶活性分別為0.98±0.10和0.95±0.13，差異無統計學意義(t=0.411，P>0.05)，證明EZH2是miR-101的下游結合靶點。

sh-control組、sh-XIST組、miR-control組、miR-101組細胞EZH2蛋白相對表達量分別為1.08±0.14、0.24±0.09、1.00±0.11和0.30±0.13(圖5)。與sh-control和miR-control組比，sh-XIST組和miR-101組細胞EZH2蛋白表達降低(t值分別為3.019、3.120，P值均<0.05)，提示lncRNA XIST靶向調節miR-101/EZH2蛋白的表達。

圖5 sh-control組(1)、sh-XIST組(2)、miR-control組(3)、miR-101組(4)細胞EZH2表達

討 論

lncRNA是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，但可以在多種層面上調控基因的表達[9-10]，與腫瘤發生發展密切相關。lncRNA XIST是目前已經鑒定出的lncRNA成員之一，具有多個生物學功能，包括調節染色體沉默、炎癥反應、腫瘤發生和化療耐藥性等[11-13]。lncRNA XIST通過作用于不同的分子參與了腫瘤如結腸癌、肺癌和宮頸癌等的發生和發展。本課題組曾采用非編碼RNA測序發現lncRNA XIST和miR-101在胰腺癌組織中呈現異常表達(待發表)。本研究通過熒光定量PCR法驗證了lncRNA XIST在胰腺癌組織顯著上調，而miR-101在胰腺癌組織顯著下調，進一步分析顯示，胰腺癌的分化程度越高、TNM分期越高、淋巴結轉移的癌組織中lncRNA XIST表達顯著增加，而miR-101顯著下降，差異有統計學意義，與文獻報道類似[14-17]。

生物信息學發現lncRNA XIST與miR-101之間存在堿基互補。lncRNA主要作用方式是靶向miRNA，調控miRNA的表達水平，進而調控下游目的基因的表達。本研究結果顯示lncRNA XIST靶向與miR-101結合，導致游離miR-101的水平下調。沉默lncRNA XIST表達可顯著抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲能力，而過表達miR-101則可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力，體內增殖實驗也進一步證實了體外細胞實驗的結果。

通過生物信息學檢索，顯示EZH2是miR-101的靶基因。EZH2基因編碼的是一種組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶，參與DNA甲基化從而抑制其他基因轉錄，EZH2也可甲基化組蛋白H3第27位賴氨酸。EZH2的甲基化活性促進異染色質的形成從而使基因沉默，是PRC2復合物的組分之一[18-20]。EZH2突變或過表達與多種類型癌癥相關，如乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和膀胱癌等[21]。本研究采用熒光素酶報告基因檢測，結果顯示沉默胰腺癌PANC1細胞lncRNA XIST表達，或者過表達miR-101，均導致EZH2蛋白表達水平顯著下調，提示腫瘤組織中lncRNA XIST水平升高，使其與更多的miR-101結合，導致游離的miR-101水平下降，進而導致癌基因EZH2蛋白水平升高，促進了胰腺癌的發生。

綜上所述， lncRNA XIST與miR-101表達異常參與了胰腺癌的發生發展過程，lncRNA XIST通過miR-101/EZH2軸調節胰腺癌細胞的增殖和侵襲力，進而促進胰腺癌的發生發展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突