穿心蓮內(nèi)酯延緩急性胰腺炎相關(guān)腎損傷的代謝組學(xué)研究

邵國建 王雷 鄭約楠 張一帆 邵玲就 司亞晨

1溫州市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，溫州 325000；2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；3海軍軍醫(yī)大學(xué)研究生院，上海 200433

急性腎損傷是AP常見的臨床并發(fā)癥，AP并發(fā)急性腎損傷患者的病死率是未并發(fā)急性腎損傷患者的10倍以上[1-2]。由此可見，AP相關(guān)腎損傷嚴(yán)重制約AP的救治成功率。AP誘發(fā)的炎癥相關(guān)的瀑布級聯(lián)效應(yīng)以及血流動力學(xué)紊亂，被認(rèn)為是引起急性腎損傷的可能機(jī)制，其中相關(guān)的細(xì)胞因子(如IL-6、TNF-α等)、急性時相反應(yīng)蛋白(如C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣物質(zhì)A等)以及降鈣素原可能為AP相關(guān)腎損傷的早期預(yù)測因子[2-3]。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AG)作為植物中藥穿心蓮的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫等作用，是一種潛在的肝保護(hù)劑[4]。此外，既往研究還提示AG不僅可以通過保護(hù)胰島免受氧化損傷改善胰島素抵抗，降低血糖，還可以通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥等抑制糖尿病腎病的進(jìn)展[5-6]。然而AG是否對AP以及AP相關(guān)腎損傷存在保護(hù)作用目前尚不清楚。本研究旨在探討AG對AP相關(guān)腎損傷的影響，并利用代謝組學(xué)方法分析潛在機(jī)制。

材料與方法

一、材料

8周雄性C57BL/6小鼠(體重20～25 g)購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司；AG總酯磺化物購于江西青峰制藥有限公司；左旋精氨酸以及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)均購于上海西格瑪-奧德里奇公司；生物化學(xué)指標(biāo)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司。

二、動物模型建立及分組

將32只小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、AP組、AG治療組及AG對照組，每組8只。對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射；AP組腹腔注射左旋精氨酸2 g/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg制備AP模型，每天1次，連續(xù)3 d；AG治療組在制模前8 h靜脈注射AG注射液1 ml，連續(xù)3 d；AG對照組在給予生理鹽水腹腔注射前8 h靜脈注射AG注射液1 ml，連續(xù)3 d。AG注射液使用劑量參考賈金虎等[7]應(yīng)用AG總酯磺化物治療膿毒癥的臨床研究中使用的劑量，即5 mg·kg-1·d-1，換算成小鼠使用的劑量為45.5 mg·kg-1·d-1，約1 mg/d，故本研究采用劑量為1 g/L的AG注射液1 ml/d。

三、標(biāo)本收集

干預(yù)完成24 h后，對所有小鼠行眼內(nèi)眥靜脈取血，4℃冰箱靜置40 min后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min、離心半徑15 cm離心5 min，取血清置于-80℃冰箱保存。取血后處死小鼠，行心臟灌流，取胰腺組織和雙側(cè)腎臟。取一半胰腺組織及左側(cè)腎臟置于甲醛溶液中固定保存。另一半胰腺組織及右側(cè)腎臟液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存。

四、血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平和胰腺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測

采用碘-淀粉比色法檢測血清淀粉酶活性；采用ELISA試劑盒檢測血清肌酐及尿素氮水平。取出-80℃冰箱儲存的胰腺組織，按重量體積比1∶19加入勻漿介質(zhì)制備成5%組織勻漿，采用比色法檢測胰腺組織MPO活性。

五、胰腺及腎組織病理學(xué)分析

取甲醛固定的胰腺及腎組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查。每張切片觀察5個視野，由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行讀片并評分。參照Schmidt等[8]方法對胰腺病理進(jìn)行半定量評分：0分，正常胰腺；1分，小葉間區(qū)域性水腫，腺管邊緣炎癥，實(shí)質(zhì)出血<25%，無明顯實(shí)質(zhì)壞死；2分，小葉間彌漫性水腫，實(shí)質(zhì)炎癥及出血<50%，點(diǎn)狀實(shí)質(zhì)壞死<20%；3分，腺泡腫脹，小葉間隙增大，實(shí)質(zhì)炎癥及出血<75%，小葉缺失<50%；4分，明顯小葉分離，實(shí)質(zhì)炎癥及出血>75%，小葉缺失>50%。參照Zhou等[9]方法對腎臟病理進(jìn)行半定量評分：0分，正常腎小管；1分，僅有腎小管上皮細(xì)胞變性而無壞死；2分，近端腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、增生、管腔擴(kuò)張、蛋白管型、間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤等改變≤25%；3分，上述改變≤50%；4分，上述改變≤75%；5分，上述改變>75%。

六、腎組織代謝組學(xué)分析

取出-80℃冰箱儲存的腎組織，取皮髓交界部分，稱取50 mg加入含內(nèi)標(biāo)(二氯苯丙氨酸)的甲醇溶液1 ml，加入碾磨珠，4℃、70 Hz碾磨120 s，再置入4℃離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min、離心半徑15 cm離心10 min，取上清200 μl上樣。余上清每個取10 μl混合成質(zhì)量控制液(quality control, QC)，渦旋后取200 μl上樣。

采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectro-metry, UHPLC-Q-TOF/MS)系統(tǒng)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。使用美國Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀和Agilent 6538高分辨四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀。色譜柱使用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)。流動相包括0.1%甲酸(A)和混合了0.1%甲酸的乙腈(B)。優(yōu)化的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)洗脫條件為：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～15% B；10～14 min，15%～30% B；14～17 min，30%～95% B；17～19min，95% B；平衡時間為6 min；流速為0.4 ml/min；進(jìn)樣量為2 μl；自動進(jìn)樣器溫度保持4℃。電噴霧離子源采用正、負(fù)離子模型。質(zhì)譜具體參數(shù)：毛細(xì)管電壓，正離子模式下3 500 V，負(fù)離子模式下4 000 V；干燥器流速11 L/min；氣體溫度350℃；霧化器壓力45 psi；fragmentor電壓120 V；skimmer電壓60 V。質(zhì)譜的采集范圍50～1 100 m/z。參比離子：正離子模式下121.0509，922.0098；負(fù)離子模式下112.98558700，1033.98810900。使用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)一步分析潛在的生物標(biāo)志物，并將碰撞能量設(shè)置為10～50 eV。

七、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)處理

原始數(shù)據(jù)通過Agilent MassHunter軟件，由UHPLC-MS格式轉(zhuǎn)換為通用數(shù)據(jù)格式(mzdata)文件。排除同位素干擾，閾值設(shè)定為0.1%。用XCMS(http://metlin.scripps.edu/download/)程序?qū)R時域數(shù)據(jù)的峰值、峰值強(qiáng)度的提取和自動積分。保留時間比對和峰積分以生成可視數(shù)據(jù)矩陣。基于80%原則過濾離子后，將每個樣品中檢測到的離子標(biāo)準(zhǔn)化為峰面積的總和，以校正質(zhì)譜響應(yīng)偏移，獲得代謝物的相對強(qiáng)度。將包括樣品名稱、保留時間、質(zhì)荷比和標(biāo)準(zhǔn)化離子強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)矩陣居中和帕累托縮放后，導(dǎo)入SIMCA-P程序，以進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析。采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)進(jìn)行排列測試以評估模型的質(zhì)量，生成變量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)， 選擇VIP>1.0的代謝物用于進(jìn)一步分析。

結(jié) 果

一、各組小鼠血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平及胰腺組織MPO活性比較

AP組血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平及胰腺組織MPO活性顯著高于對照組，AG治療組又顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，而對照組與AG對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

二、各組小鼠胰腺及腎組織病理評分比較

對照組及AG對照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)基本正常；AP組胰腺表現(xiàn)為小葉間隙增大，小葉間炎細(xì)胞浸潤明顯，部分腺泡細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞核固縮；AG治療組僅表現(xiàn)為部分小葉水腫及小葉間隙輕度增大(圖1A～1D)。對照組、AP組、AG治療組和AG對照組小鼠胰腺組織病理評分分別為(0.20±0.12)、(2.70±0.26)、(1.40±0.19)、(0.10±0.10)分，AP組顯著高于對照組，AG治療組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，而AG對照組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平及胰腺組織MPO活性比較

注：MPO為髓過氧化物酶；AP為急性胰腺炎；AG為穿心蓮內(nèi)酯。與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

對照組及AG對照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常；AP組表現(xiàn)為腎小管上皮壞死，上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核丟失或空泡化，間質(zhì)部分炎細(xì)胞浸潤；AG治療組僅表現(xiàn)為部分腎小管上皮細(xì)胞核丟失或空泡化(圖1E～1H)。對照組、AP組、AG治療組和AG對照組小鼠腎組織病理評分分別為(0.30±0.12)、(3.00±0.35)、(1.70±0.26)、(0.20±0.20)分，AP組顯著高于對照組，AG治療組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，而AG對照組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示本研究給予的AG劑量對腎組織無毒性。

三、腎組織代謝組學(xué)分析

正、負(fù)離子模式下的PCA結(jié)果提示，對照組、AP組和AG治療組之間存在一定差異(圖2A、2B)。進(jìn)一步行正、負(fù)離子模式下的PLS-DA篩選差異代謝物，平面圖顯示AP組與對照組顯著分開，而AG治療組與對照組接近(圖2C、2D)。通過VIP>1.0、P<0.05的篩選，共獲得31個代謝物可能與AG治療AP相關(guān)腎損傷的作用相關(guān)(表2)。這31個代謝物主要參與氨基酸代謝和脂肪酸代謝，少部分還參與糖代謝、核苷酸代謝、維生素代謝以及膽汁酸代謝。其中硫酸吲哚酚作為常見的小分子尿毒癥毒素，在AP相關(guān)腎損傷時顯著升高，而AG治療則降低了硫酸吲哚酚的生成。此外，馬尿酸、甲基馬尿酸、4-氨基馬尿酸、對甲酚硫酸鹽、對甲酚葡萄糖醛酸等尿毒癥毒素在AP相關(guān)腎損傷時也顯著升高，給予AG治療后這些代謝物水平下降。提示AG可能通過改變腎組織代謝物水平從而起到治療作用。

圖1 對照組、AP組、AG治療組及AG對照組胰腺組織(1A～1D)和腎組織(1E～1H)病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×400)

圖2 正、負(fù)離子模式下對照組、AP組及AG治療組的PCA(2A、2B)和PLS-DA(2C、2D)平面圖

表2 AG治療AP相關(guān)腎損傷的差異代謝物及其代謝途徑

注：AG為穿心蓮內(nèi)酯；AP為急性胰腺炎

討 論

代謝組學(xué)作為反應(yīng)疾病內(nèi)環(huán)境或者外源性刺激與內(nèi)源性代謝物之間關(guān)系的一種方法，近年來被廣泛應(yīng)用于各種疾病以及藥物治療研究中。本研究利用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)共有31個差異代謝物與AP相關(guān)腎損傷以及AG的治療作用相關(guān)，這些代謝物主要參與氨基酸和脂肪酸代謝。

在氨基酸代謝中，硫酸吲哚酚、對甲酚硫酸鹽、馬尿酸、甲基馬尿酸、4-氨基馬尿酸等尿毒癥毒素均在AP相關(guān)腎損傷時明顯升高，而經(jīng)過AG治療后發(fā)生回調(diào)。硫酸吲哚酚作為常見的小分子尿毒癥毒素，其主要是由色氨酸在肝臟或腸道微生物的硫酸化作用下產(chǎn)生，并且由尿液排出[10]。既往研究顯示，硫酸吲哚酚水平不僅在急性腎損傷時升高，而且還可以增強(qiáng)炎癥遞質(zhì)介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加心血管疾病風(fēng)險[11-12]。硫酸吲哚酚在AP相關(guān)腎損傷時顯著升高，究其原因，一可能是由于腎功能減損，硫酸吲哚酚隨尿液排出減少；二可能是由于腸道屏障功能受損，腸道菌群失調(diào)，色氨酸在微生物途徑下產(chǎn)生硫酸吲哚酚等毒素增多。AP時TNF-α可以增加腸道通透性，促進(jìn)上皮細(xì)胞的細(xì)菌易位，引起腸道菌群失調(diào)，同時影響腸道淋巴組織功能，炎癥遞質(zhì)通過腹腔淋巴循環(huán)侵入全身循環(huán)，可誘導(dǎo)終末器官衰竭[13]。因此，可以推測AP誘導(dǎo)的腸道屏障功能受損使腸道菌群失調(diào)，增強(qiáng)了色氨酸的微生物途徑，使硫酸吲哚酚等多種毒素產(chǎn)生增加。AG作為一種具有抗菌活性的天然化合物，可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，修復(fù)腸道屏障，從而對AP相關(guān)腎損傷起到保護(hù)作用。

在脂肪酸代謝中，所有肉堿類物質(zhì)在AP相關(guān)腎損傷時均存在下調(diào)，而AG治療則可以使這些代謝物水平回升。有研究發(fā)現(xiàn)肉堿在順鉑誘導(dǎo)的腎損傷以及缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷中起到保護(hù)作用[14-15]，提示肉堿在AP相關(guān)腎損傷時同樣發(fā)揮保護(hù)作用。肉堿作為脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵物質(zhì)，其在脂肪酸從線粒體膜間轉(zhuǎn)移至線粒體基質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用。既往研究提示脂肪酸β-氧化受損會引起腎臟纖維化加重，而修復(fù)脂肪酸β-氧化可以延緩腎臟疾病的進(jìn)展[16]。因此推測AG可能通過提高肉堿水平，增強(qiáng)脂肪酸β-氧化，從而在AP相關(guān)腎損傷時起到保護(hù)作用。脂肪酸代謝中的溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholines，LPCs)在AP相關(guān)腎損傷中均存在下調(diào)，而在AG治療后回升。有研究發(fā)現(xiàn)在慢性腎臟疾病和血液透析患者中，隨著腎臟疾病的進(jìn)展，LPCs水平不斷降低，且LPCs水平還與患者的預(yù)后生存相關(guān)，證實(shí)其在腎臟中的保護(hù)作用[17-18]。因此，LPCs的水平可能也與AP相關(guān)腎損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且有可能成為預(yù)測疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)。既往還有研究提示，適當(dāng)劑量的LPCs可能通過降低炎癥遞質(zhì)IL-1β從而減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥損傷[19]，推測AG可能通過提高LPCs水平，減少IL-1β等炎癥遞質(zhì)，從而減輕AP相關(guān)腎損傷。

既往關(guān)于AG引起的急性腎損傷在臨床中時有報道[20-21]，動物實(shí)驗(yàn)也有提及AG具有腎毒性[22]。但本研究結(jié)果顯示，AG對AP相關(guān)腎損傷具有保護(hù)作用，究其原因，可能與AG結(jié)合的鹽類化合物性質(zhì)不同有關(guān)。在AG腎毒性動物實(shí)驗(yàn)中所用到的化合物為亞硫酸氫鈉AG，與本實(shí)驗(yàn)用到的AG總酯磺化物不同，這兩種化合物在臨床對應(yīng)的藥物分別是蓮必治注射液和喜炎平注射液。臨床分析AG不同鹽類注射劑的不良反應(yīng)結(jié)果表明，蓮必治注射液腎損害發(fā)生率高，而喜炎平注射液幾乎不引起腎損害[23]，因此在臨床中應(yīng)當(dāng)避免對腎功能不全患者使用蓮必治注射液。AG不同鹽類注射劑的安全性以及臨床不良反應(yīng)值得進(jìn)一步分析。

總之，本研究結(jié)果提示AG可能通過改變代謝物的水平對AP相關(guān)腎損傷起到保護(hù)作用，但其中的具體作用機(jī)制有待后續(xù)更深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突