基于網絡藥理學的梔子-川芎藥對抗抑郁實驗研究

李筱楠,雍淇文,張 銘,姚文靜,王佳豪,馮 強,王 娜*,王俊霞*,崔力劍

(1.石家莊鐵路職業技術學院,石家莊 050000； 2.河北醫科大學,石家莊 050000；3.寧晉縣中西結合醫院檢驗科,河北 邢臺 055550； 4.河北中醫學院,石家莊 050000)

抑郁癥(major depressive disorder, MDD)是以顯著而持久的心境低落、思維遲緩和認知功能損害為主要臨床癥狀的疾病[1]。 據WHO 統計:2005 到2015 十年間,全球抑郁癥患者人數增長18.4%,已達3.22 億。 抑郁癥會導致患者有自殺、自殘等行為,目前每年約80 萬人因此自殺,同時抑郁癥也是全球首要致殘因素。 可見抑郁癥已經成為嚴重的全球性公共衛生問題[2]。 中國的抑郁癥患病率為4.2%,屬于高患病率國家之一[3]。

長期以來,傳統藥物治療一直是對抗抑郁癥的重要手段,而中藥抗抑郁效果尤為突出。 根據一項薈萃分析研究顯示,單獨采用中藥治療抑郁癥的效果優于安慰劑,與化藥相當,且副作用發生率比化藥少[4]。

由蒼術、香附、川芎、神曲、梔子組成的經典方劑越鞠丸,始載于元代著名醫家朱震亨的《丹溪心法》——“越鞠丸,解諸郁”。 現代臨床和藥理學研究均表明,越鞠丸具有抗抑郁活性[5]。 有學者對越鞠丸依次拆方,將不同中藥藥對組合,并通過動物實驗對其進行抗抑郁作用的篩選,結果發現梔子—川芎組合為越鞠丸發揮抗抑郁作用的關鍵藥對,且川芎能夠提高梔子的抗抑郁效果[6-7],但梔子-川芎藥對的抗抑郁物質基礎和作用機制還鮮有報道。本文擬采用網絡藥理學研究方法,對梔子-川芎抗抑郁的主要功效成分及其作用機制進行探討,以期揭示梔子-川芎在越鞠丸中配伍的科學內涵。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5 周齡雄性ICR 小鼠,224 只,體重23 ～25 g,SPF 級,購于河北醫科大學動物學部[SCXK(冀)2018-004],飼養條件:恒溫(23±2)℃,恒濕(60±5)%,光暗周期循環(12/12 h),分籠飼養,自由攝取食物及水,飼養于河北醫科大學醫學與健康研究實驗動物公共服務平臺[SYXK(冀)2018-0008]。 所涉及的實驗獲得河北醫科大學醫學倫理委員會批準(NO IACUC-Hebmu-2019004),并根據3R 原則對實驗動物的飼養及使用給予人道關懷。

1.2 主要試劑

丁基苯酞、Jasminoside J、Gardenal-I、4-methoxylphenethyl-butyl ether、由實驗室自制；鹽酸氟西汀購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 化學成分的收集與整理

通過Web of Science,CNKI,Sciencedirect 等數據庫進行文獻檢索,收集到梔子中的化學成分219個,川芎121 個。 然后采用ChemBioDraw Ultra 14.0繪制所有化學成分的結構式,保存為cdx 格式。 再采用OpenBable 2.4.1 將cdx 格式轉換為SMILE 格式,備用。

1.3.2 類藥性分析

類藥性是口服中藥成分的重要參數,本文將上述收集得到的梔子-川芎藥對的化合物導入Swiss ADME,預測其吸收性質,并篩選出符合類藥性五原則的化合物(即Lipinski #violations=0)。

1.3.3 化合物作用靶點的預測

將梔子-川芎中符合類藥性五原則的化合物導入Swiss Target Prediction 數據庫(http:/ /www.swisstargetprediction.ch/),進行化合物的作用靶點分析。 下載包含靶標預測結果的數據文件,備用。

1.3.4 梔子-川芎抗抑郁的相關作用靶點篩選

在GeneCards 數據庫(http:/ /www.genecards.org/)中檢索與抑郁癥相關的疾病靶點(relevance score＞150),并將上述靶點與梔子-川芎的化合物作用靶點進行匹配,相同的靶點即被認為是梔子-川芎抗抑郁活性成分的潛在作用靶點。

1.3.5 蛋白質相互作用網絡構建與分析

將梔子-川芎抗抑郁活性成分的潛在作用靶點導入String 數據庫(https:/ /string-db.org/),進行蛋白質相互作用網絡分析,分析結果保存為TSV 格式文件,保存文件中的node1、node2 和Combined score等信息,然后導入Cytoscape Version 3.7.0 進行蛋白質相互作用網絡分析,根據degree 值對梔子川芎抗抑郁的關鍵靶點進行預測。

1.3.6 梔子-川芎抗抑郁關鍵靶點的信號通路分析

采用Cytoscape Version 3.7.0 軟件中的cluego插件,對梔子-川芎藥對的關鍵抗抑郁作用靶點進行KEGG 信號通路分析,設定閾值P＜0.05。

1.3.7 梔子-川芎藥對化學成分-作用靶點-信號通路網絡構建與分析

將梔子-川芎抗抑郁的關鍵靶點、與關鍵抗抑郁靶點相對應的抗抑郁活性成分以及抗抑郁關鍵靶點的信號通路,導入Cytoscape Version 3.7.0 軟件,構建梔子-川芎抗抑郁活性成分-作用靶點-信號通路網絡。 在該作用網絡中,節點分別代表活性成分、作用靶點或信號通路,邊代表活性成分-作用靶點、作用靶點-信號通路相連接,若與活性成分相對應的作用靶點在某一信號通路中,也將該活性成分與該信號通路以邊相連接。

1.3.8 實驗動物分組及給藥

強迫游泳實驗和懸尾實驗各采用224 只小鼠,隨機分為28 組,每組8 只,分別為空白對照組(蒸餾水),陽性對照組鹽酸氟西汀(10 mg/kg),丁基苯酞組(10、 30、 90 mg/kg), Gardenal-I 組(50、 100、 200 mg/kg),Jasminoside J 組(10、30、90 mg/kg),4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 組(10、30、90 mg/kg)。依據文獻[6-7]及前期預實驗結果,實驗動物連續灌胃給予相應藥物14 d。

1.3.9 小鼠懸尾實驗

在第14 天,小鼠灌胃給藥60 min 后,用膠帶將小鼠懸于距地面50 cm 處的尾部,膠帶貼于距尾部1 cm 處。 開始時小鼠頭部可上下左右擺動,一段時間后因失望而使活動減少,即出現間斷性不動狀態。 整個實驗需要6 min 完成,記錄最后4 min 內累積不動時間。

1.3.10 小鼠強迫游泳實驗

在第14 天,小鼠灌胃給藥60 min 后,將小鼠分別放入一個直徑為20 cm,高度為50 cm 的圓筒中,圓筒中水的高度為40 cm,水溫為(24±1)℃。 觀察時間為6 min,記錄后4 min 內的累積不動時間。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 梔子-川芎活性成分的抗抑郁靶點預測

通過類藥性分析,梔子和川芎兩種藥材中分別有92 和87 個化合物符合類藥性五原則的要求,通過Swiss Target Prediction 數據庫發現上述兩種藥材的化合物的作用靶點分別有1380 和1433 個,去除重復后,分別得到293 和329 個靶點。 通過與GeneCards 數據庫中的抑郁癥相關基因進行對比,發現分別有23 和19 個與梔子和川芎治療抑郁癥相關的作用靶點,其中兩種藥材共有的抗抑郁相關靶點為11 個,詳見表1。

表1 梔子-川芎藥對潛在的抗抑郁靶點信息Table 1 Information on the protein targets of the active ingredients in Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum and their antidepressant effects

2.2 蛋白相互作用網絡構建與分析

將上述31 個作用靶蛋白導入String 數據庫,限定物種為人,獲取的蛋白相互作用結果導入Cytoscape 軟件,構建相互作用網絡并進行分析,結果見圖1。

圖中節點表示蛋白,邊表示蛋白之間的關聯,節點越大表示degree 值越大,說明其在梔子-川芎抗抑郁過程中就可以發揮更重要的作用。 在圖1 中,degree 值大于中位數的靶點分別為COMT、HTR1A、DRD2、 SLC6A4、 SLC6A3、 MAOA、 GRM5、 DRD4、DRD3、 HTR2A、 HTR3A、 GRIA1、 APP、 HTR1B和GRM1。

2.3 信號通路分析

利用Cytoscape Version 3.7.0 軟件中的cluego插件進行KEGG 信號通路分析。 如圖2 所示,梔子-川芎抗抑郁關鍵靶點主要涉及Serotonergic synapse、Dopaminergic synapse、 Taste transduction、 Gap junction、Long-term potentiation、Cocaine addiction 和Amphetamine addiction 等7 條信號通路。

2.4 梔子-川芎的抗抑郁活性成分-作用靶點-信號通路網絡分析

將梔子-川芎抗抑郁活性成分、作用靶點和信號通路導入Cytoscape 軟件,構建了活性成分-作用靶點-信號通路網絡,結果見圖3。 圖中紅色和黃色分別代表梔子和川芎的抗抑郁活性成分,藍色為抗抑郁關鍵靶點,綠色代表信號通路。 Degree 值是評價某節點在整個靶標網絡中重要性的關鍵參數。 本文采用Cytoscape 軟件中的Tools-Analyze Network 插件,計算出靶標網絡中所有節點的degree 值。 根據degree 值,發現梔子-川芎藥對的關鍵活性成分為jaminoside J(Z54)、4-methoxyl-phenethyl-butyl ether(Z8)、butylphthalide(C19,丁基苯酞)、Gardenal-I(Z112)(degree 值均≥7,在梔子-川芎藥對的活性成分中排名前四),活性成分名稱和結構式見圖4；關鍵信號通路為KEGG:04728(Dopaminergic synapse)和KEGG:04726(Serotonergic synapse)(degree 值均≥39)。

圖1 梔子-川芎藥對的蛋白質互作網絡圖Figure 1 Protein-protein interactions involved in the antidepressant effects of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum

圖2 梔子-川芎抗抑郁關鍵靶點的KEGG 信號通路富集分析Figure 2 KEGG pathway enrichment analysis of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum compounds with antidepressant activity

圖3 梔子-川芎藥對抗抑郁活性成分-作用靶點-信號通路網絡Figure 3 Component-target-pathway network of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum compounds with antidepressant activity

2.5 藥理活性驗證

在懸尾實驗和強迫游泳實驗中,與空白組相比,陽性對照組、丁基苯酞和Gardenal-I 中、高劑量組均能顯著性減少不動時間、4-methoxyl-phenethylbutyl ether 高劑量組能減少不動時間(見表2),進一步驗證了這幾個化合物具有一定抗抑郁活性,但jaminoside J 組顯示未能明顯減少不動時間,說明jaminoside J 未顯示出明顯的抗抑郁活性。

抑郁癥是嚴重影響國人健康的重大疾病,現代研究發現,越鞠丸具有明確的抗抑郁效果,而梔子-川芎是越鞠丸中抗抑郁的主要活性藥對[7-8],其中梔子苦寒,可化郁久之熱,又因其具有解郁除煩之效,因此,丹梔逍遙散、梔子豉湯等多種抗抑郁的經典方劑中均配伍有梔子,多項研究報道也發現梔子是臨床治療抑郁癥的一味常用中藥[9-10]。 川芎為血中氣藥,上行頭目,下調經水,中開郁結。 川芎配伍梔子可引其上行頭目,發揮增加療效之功[11-12],但是兩種配伍的抗抑郁物質基礎和作用機制還不明確。

3 討論

圖4 梔子-川芎抗抑郁活性成分Figure 4 Components of Gardenia jasminoides Ellis-processed Ligusticum with antidepressant effects

本研究利用網絡藥理學的技術和方法,探討梔子-川芎藥對配伍治療抑郁癥的活性成分、活性靶點及相關的作用通路。 通過數據挖掘找到梔子和川芎的成分共179 個,進一步根據degree 值篩選出梔子-川芎藥對的關鍵活性成分為jaminoside J、4-methoxyl-phenethyl-butyl ether、butylphthalide(丁基苯酞)、Gardenal-I,其中丁基苯酞是川芎中重要的活性成分之一,目前已經發現其對中樞神經系統和心血管系統的多種疾病具有良好的治療作用[13]。 藥理實驗已經表明,川芎能改善長期慢性應激實驗大鼠的抑郁癥狀[13]。 臨床研究表明,丁基苯酞聯合化藥(帕羅西汀、氟西汀、曲唑酮等)對卒中后抑郁的治療效果良好,能夠保護神經功能缺損[14-16]。 Gardenal-I為梔子中環烯醚萜類結構,已有大量實驗結果證明梔子中的環烯醚萜類結構具有抗抑郁活性[17]。 4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 和jasminoside J 分 別為梔子中簡單苯丙素類和單萜類結構,但目前就這兩種化合物抗抑郁效果鮮有報道。 本文在網絡藥理學預測基礎上使用ICR 小鼠進行了上述四類化合物抗抑郁活性初步測試。 結果發現丁基苯酞和Gardenal-I 中、高劑量組具有顯著抗抑郁活性,4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 高劑量組具有抗抑郁活性,jasminoside J 無抗抑郁活性。 結合網絡藥理學及動物實驗初步預測,丁基苯酞、Gardenal-I 及4-methoxyl-phenethyl-butyl ether 可能是越鞠丸抗抑郁的關鍵性成分,但這并不代表越鞠丸的抗抑郁活性完全是由這幾種成分決定的。 由于網絡藥理學的研究方法是從“多成分-多靶點”的復雜網絡體系中,篩選得到對整個網絡影響最大的成分,在研究過程中,并未能考慮到藥物血藥濃度等問題,所以,本實驗在進行動物實驗驗證中,也并未考慮上述幾種單體成分在臨床給藥劑量下能否達到等問題,這也是該研究方法存在的不足之處。

表2 不同化合物對懸尾和強迫游泳實驗小鼠不動時間的影響(ˉx ± s, n=8)Table 2 The effects of different compounds on forced swimming and tail suspension tests in mice

此外,網絡藥理學預測發現梔子-川芎抗抑郁活性成分主要作用于 Dopaminergic synapse 和Serotonergic synapse 等信號通路,而前期研究已經發現多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)等單胺類神經遞質與抑郁癥的發病密切相關[18-19]。 很多現代臨床治療抑郁癥的一線化藥也主要針對單胺類神經遞質的相關靶點,提高體內單胺類神經遞質的濃度以達到治療抑郁癥的目的[20-22]。

綜上所述,本文采用網絡藥理學的研究方法,探討了梔子-川芎藥對的多成分、多靶點與抑郁癥疾病之間的復雜作用網絡,初步探索了梔子-川芎藥對抗抑郁物質基礎,為進一步研究奠定了一定的基礎。