miRNA-144 基因過表達對肝癌小鼠的抑瘤作用及對腸道菌群的影響

王 雨,許達峰,周開倫,武金才,丁驛超,古海強,謝明微,劉向梅

(海南省人民醫院肝膽胰外科,海口 570031)

原發性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一,病死率僅次于肺癌,居于第2 位,其發病率逐年增長[1]。 肝硬化時,腸黏膜通透性增高與腸道細菌移位及腸源性內毒素血癥密切相關,進而增加細胞癌變風險,肝硬化、肝癌患者存在腸道細菌紊亂的情況[2]。 腫瘤的侵襲、轉移受多基因調控影響,目前腫瘤的基因治療已成為醫學研究的熱點[3]。 研究表明[4-6],微小RNA-144(microRNA-144,miRNA-144)是與腫瘤密切相關的miRNA,在食管癌、甲狀腺癌、大腸癌組織中均有異常表達,且參與細胞發育分化過程中蛋白與基因的合成環節。 楊銳[7]認為,miRNA-144 在膽管癌組織和膽管癌細胞系中的表達降低,推測miRNA-144 可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。 目前,關于miRNA-144 與惡性腫瘤的相關性研究較多,但關于其對肝癌及腸道菌群影響的研究尚少。 本研究對miRNA-144 基因過表達對肝癌小鼠的抑瘤作用及對腸道菌群的影響進行探討,旨在為肝癌的基因治療及腸道功能紊亂的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 雄鼠,4 周齡,43 只,體重20～22 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養于海南醫學院動物實驗中心[SYXK(京)2017-0033]。 自由進水飲食,溫度維持在23℃～25℃,相對濕度50%～60%,12 h/12 h 明暗交替安靜環境下適應性飼養1 周,實驗研究過程做到了減少、替代、優化的3R 原則,動物實驗開展前獲得實驗動物倫理委員會審批(IACUC-20180509-44)。

1.2 主要試劑與儀器

腹水型肝癌H22 細胞株(中國科學院上海細胞庫)；miRNA-144 高表達慢病毒顆粒(上海吉滿生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(上海研謹生物科技有限公司)；DAB 顯色試劑(北京索萊寶科技有限公司)；緊密鏈接跨膜蛋白(occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)多克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)；SP 免疫組化試劑盒、蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin HE)染色試劑盒、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌選擇性培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)；糞便QIAamp? DNA Stool Mini Kit(德國Qiagen 公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、全段酶標儀(美國Bio-Rad 公司)；石蠟切片機(德國SLEE 公司)；光學顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備移植性腹水型肝癌

取33 只小鼠,腹水型肝癌H22 細胞株復蘇,體外培養傳代至對數生長期,1 000 r/min 離心5 min,PBS 緩沖液清洗2 次,取中上層細胞,生理鹽水4 倍稀釋,每只小鼠右前腋下無菌皮下接種0.2 mL,接種完成后正常飼養2 周。 定期以游標卡尺測量小鼠腋下瘤塊長短徑,待腫瘤最長徑為0.8 ～1 cm 時為造模成功,進行實驗干預。

1.3.2 實驗分組及干預

選取建模成功小鼠30 只,隨機分為模型組、空載組和過表達組,每組10 只,另選取10 只健康對照小鼠為對照組。 建模成功小鼠于建模后24 h進行尾靜脈注射,空載組小鼠注射空載體慢病毒液0.1 mL,過表達組注射miRNA-144 高表達慢病毒液0.1 mL,對照組與模型組小鼠于同時間注射生理鹽水0.1 mL,注射完畢后繼續飼養3 d,期間觀察記錄小鼠的精神狀況、毛色變化、進食量、體重及排便情況。

1.3.3 組織取材及糞便采集

各組小鼠在干預結束后24 h 脫頸處死,觀察腫瘤形成情況,剝離腫瘤組織,稱量模型組、過表達組瘤重,計算抑瘤率,并取正常肝組織、肝癌組織及結腸組織,儲存于-80℃冰箱備用。 抑瘤率=[模型組平均瘤重(g)-過表達組平均瘤重(g)]/模型組平均瘤重(g)×100%。 無菌收集小鼠處死前48 h 內新鮮直腸糞便(≥200 mg),迅速裝入無菌凍存管中儲存于-80℃冰箱備用。

1.3.4 組織病理學觀察

取小鼠肝及結腸組織標本,PBS 溶液沖洗干凈,4%多聚甲醛溶液固定,常規石蠟包埋,制成4 μm 厚切片,常規HE 染色,于光學顯微鏡下觀察肝組織及結腸組織病理變化。

1.3.5 盲腸內容物菌群豐度及多樣性檢測

按照糞便DNA 基因組提取試劑盒說明提取樣本基因組DNA,進行細菌PCR 擴增,通用引物forward primer(5’-3’)序列:ATGCTCGACTGTAGCT AGTG-3(F341)reverse primer(5’-3’)；GCTCGAT CGCATCGATATCG(R806),擴增細菌核糖體RNA基因V3～V4 區,得到500 bp 左右片段。 PCR 反應條件:95℃預變性3 min；98℃變性25 s,58℃退火15 s,72℃延伸20 s,重復30 個循環,72℃延伸5 min。應用Illumina Misq 技術對PCR 產物進行高通量測序,根據97%相似度進行操作分類單元(operational taxonomic units,OUT)聚類,應用軟件MEGAN 分析計算菌群多樣性(shannon)指數和豐富度(chao)指數。

1.3.6 腸道屏障功能及及細菌異位率檢測

于小鼠處死前收集眼眶靜脈叢血樣,靜置分層后離心收集上層血清,檢測血清二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、內毒素水平(分光光度計法),讀取酶標儀436 nm 處吸光光密度(optical density,OD)值。 無菌獲取小鼠腸系膜淋巴結、腹腔灌洗液及肝、腎、脾、肺,分別將其置于增菌液中,需氧條件下培養24 h,涂片鑒定增菌培養陽性標本,將出現大腸桿菌或類桿菌者記為陽性,計算細菌異位率,細菌異位率=陽性器官個數/(小鼠個數×5)×100%。

1.3.7 結腸組織Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA相對表達量鑒定

取模型組、空載組、過表達組癌組織及各組結腸組織80 mg,TRIzol 法提取總RNA,以Nanodrop 系統測定RNA 樣品濃度與純度,測定260 nm、280 nm處OD 值,判斷樣品純度是否符合實驗要求,以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 定量。 以逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA,經電泳鑒定、酶標儀定量后,采用RT-PCR 法進行檢測,反應體系:Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 模板2 μL,ddH2O 5 μL；反應條件:94℃預變性10 min；95℃變性10 s,58℃退火40 s,72℃延伸48 s,重復40 個循環。 β-actin 或U6 為管家基因,2-△△Ct為目的基因的相對表達量。 實驗重復3 次,取平均值。各基因引物序列,見表1。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.3.8 結腸組織Occludin、ZO-1 蛋白相對表達量檢測

取80 mg 結腸組織,BCA 法檢測蛋白定量,取蛋白樣品50 μg 經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉60 min 后蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉TTBS 液(0.121% Tris, 0.9% NaCl, 0.1%Tween-20,pH7.5),漂洗后加Occludin 一抗(1 ∶800)或ZO-1 一抗(1 ∶500)4℃搖床孵育過夜,TTBS 液洗膜3 次,以辣根過氧化物酶標記的二抗(1:10 000)室溫孵育2 h,漂洗后ECL 曝光成像,以目的蛋白OD 值/內參β-actin 的OD 值比值為蛋白表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件分析處理數據,計量資料均以(±s)描述,多樣本計量資料比較采用方差分析,兩兩樣本比較采用SNK-q 檢驗。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及抑瘤率

對照組小鼠精神狀態良好,毛色光澤,進食量、活動量及糞便性狀正常,模型組、空載組及過表達組隨著時間的延長,精神狀態變差,毛色欠光滑,進食量下降,活動量減少,體重減輕,出現腹瀉及便血,過表達組癥狀稍輕。 過表達組抑瘤率為(35.90±5.32)%。

2.2 肝及腸道組織病理學觀察

HE 染色結果顯示,對照組肝組織中央清晰,肝細胞大小均勻,形態完整,核圓而大、居中；腸道壁結構、形態均正常。 模型組及空載組肝組織正常結構被破壞,肝索結構消失,肝細胞大小不均、排列不齊、細胞核大、深染、可見核分裂,肝小葉內見大量的碎片狀壞死,壞死周圍伴隨大量炎性細胞浸潤和增生的纖維細胞；腸道壁結構破壞嚴重,腸絨毛萎縮、排列稀疏,黏膜下層可見大量炎癥細胞浸潤,伴有上皮細胞壞死及纖維素樣滲出。 過表達組肝組織結構被破壞,細胞變性、壞死較輕,可見細胞體積固縮,部分細胞裂解,染色質濃縮,炎性細胞浸潤較輕；腸道壁結構損傷輕微,有少量的炎癥細胞浸潤,見圖1、圖2。

2.3 癌組織miRNA-144 mRNA 表達情況

模型組、空載組、過表達組miRNA-144 mRNA相對表達量分別為(0.38±0.06)、(0.39±0.07)、(0.65±0.10),3 組間比較差異有統計學意義(F=38.000,P=0.000),模型組、空載組的miRNA-144 mRNA 相對表達量低于過表達組(t=7.321、6.736,P=0.000、0.000),模型組與空載組比較,差異無統計學意義(t=0.343,P=0.736)。

2.4 腸道內容物菌多樣性及豐度比較

各組間腸道菌群、shannon 及chao 指數比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；模型組、空載組、過表達組的雙歧桿菌、乳酸菌、shannon 及chao 指數均低于對照組(P＜0.05),大腸桿菌、腸球菌均高于對照組(P＜0.05)；模型組與空載組的雙歧桿菌、乳酸菌、shannon 及chao 指數均低于過表達組(P＜0.05),大腸桿菌、腸球菌均高于過表達組(P＜0.05)；模型組與空載組的腸道菌群、shannon 及chao 指數比較,差異無統計學意義(P＞0.05),見表2。

圖1 肝組織病理圖片(HE 染色)Figure 1 Pathological picture of liver tissue (HE staining)

圖2 結腸組織病理學圖片(HE 染色)Figure 2 Histopathological picture of colon(HE staining)

表2 腸道內容物菌群多樣性及豐度比較( ±s,n=10)Table 2 Diversity and abundance of intestinal microflora

表2 腸道內容物菌群多樣性及豐度比較( ±s,n=10)Table 2 Diversity and abundance of intestinal microflora

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01；與空載組比較,&P＜0.01。Note. Compared with the control group,△P ＜0.01.Compared with the control group,*P ＜0.01.Compared with the model group,#P ＜0.01.Compared with the no-load group,&P ＜0.01.

組別Groups雙歧桿菌(lgCFU/g)Bifidobacterium乳酸桿菌(lgCFU/g)Lactobacillus大腸桿菌(lgCFU/g)E.coli腸球菌(lgCFU/g)Enterococcus Shannon 指數Shannon index Chao 指數Chao index對照組Control group 9.01±0.80△ 8.75±0.88△ 7.55±0.88△ 6.85±0.65△ 4.10±0.55△ 836.32±65.32△模型組Model group 5.35±0.55△* 5.68±0.66△* 12.01±0.98△* 10.32±0.85△* 2.02±0.45△* 585.63±55.30△*空載組No-load group 5.30±0.57△* 5.60±0.70△* 12.10±0.95△* 10.28±0.88△* 2.05±0.50△* 584.20±56.32△*過表達組Over-expression group 6.55±0.60△*#& 7.12±0.80△*#& 10.32±0.85△*#& 9.01±0.76*#& 2.85±0.52△*#& 703.02±60.32△*#&

表3 腸道屏障功能比較( ±s,n=10)Table 3 Comparison of intestinal barrier function

表3 腸道屏障功能比較( ±s,n=10)Table 3 Comparison of intestinal barrier function

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01；與空載組比較,&P＜0.01。Note. Compared with the control group,△P＜0.01.Compared with the control group,*P＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.01.Compared with the no-load group,&P＜0.01.

組別Groups DAO(OD 值)DAO(OD value)內毒素(OD 值)Endotoxin (OD value)細菌異位率(%)Bacteria ectopic rate對照組Control group 0.132±0.010△ 0.178±0.011△ 16.32±4.01△模型組Model group 0.401±0.030△* 0.385±0.028△* 60.01±8.02△*空載組No-load group 0.405±0.035△* 0.380±0.030△* 59.63±7.80△*過表達組Over-expression group 0.252±0.022△*#& 0.298±0.025△*#& 32.33±5.40△*#&

2.5 腸道屏障功能比較

各組間血清DAO、內毒素OD 值及細菌異位率比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；模型組、空載組、過表達組的血清DAO、內毒素OD 值及細菌異位率均高于對照組(P＜0.05)；過表達組的血清DAO、內毒素OD 值及細菌異位率均低于模型組與空載組(P＜0.05)；模型組與空載組的血清DAO、內毒素OD 值及細菌異位率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。 見表3。

2.6 結腸組織Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA表達情況

各組間Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對表達量比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。 對照組、模型組、空載組的miRNA-144 mRNA 相對表達量均低于過表達組(P＜0.05),模型組、空載組低于對照組(P＜0.05)；模型組、空載組、過表達組的Occludin、ZO-1 mRNA 相對表達量均低于對照組(P＜0.05),模型組與空載組低于過表達組(P＜0.05)；模型組、空載組的Occludin、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對表達量比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。 見圖3、表4。

2.7 結腸組織Occludin、ZO-1 蛋白表達情況

各組Occludin、ZO-1 蛋白相對表達量比較,差異有統計學意義(P＜0.05)；模型組、空載組、過表達組的Occludin、ZO-1 蛋白相對表達量均低于對照組(P ＜0.05),模型組、空載組低于過表達組(P＜0.05)；模型組、空載組Occludin、ZO-1 蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。 見圖4、表5。

圖3 RT-PCR 分析結果Figure 3 RT-PCR analysis results

圖4 結腸組織中緊密連接蛋白表達情況Figure 4 The expression of tight junction protein in colonic tissue

表4 結腸組織中Occludi、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對表達量( ±s,n=10)Table 4 Relative expression of Occludi, ZO-1 and miRNA-144 mRNA in colon tissue

表4 結腸組織中Occludi、ZO-1、miRNA-144 mRNA 相對表達量( ±s,n=10)Table 4 Relative expression of Occludi, ZO-1 and miRNA-144 mRNA in colon tissue

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01；與空載組比較,&P＜0.01。Note. Compared with the control group,△P ＜0.01.Compared with the control group,*P ＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.01.Compared with the no-load group,&P ＜0.01.

組別Groups miRNA-144 Occludin ZO-1對照組Control group 1.10±0.15△ 0.95±0.10△ 1.55±0.20△模型組Model group 0.50±0.10△* 0.50±0.07△* 0.95±0.15△*空載組No-load group 0.51±0.09△* 0.49±0.08△* 0.96±0.16△*過表達組Over-expression group 2.56±0.22△*#& 0.66±0.08△*#& 1.20±0.18△*#&

表5 結腸組織中Occludin、ZO-1 的蛋白相對表達量( ±s,n=10)Table 5 Relative expression of Occludin and ZO-1 proteins in colonic tissues

表5 結腸組織中Occludin、ZO-1 的蛋白相對表達量( ±s,n=10)Table 5 Relative expression of Occludin and ZO-1 proteins in colonic tissues

注:4 組間比較,△P＜0.01；與對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05；與空載組比較,&P＜0.05。Note. Compared with the control group,△P ＜0.01.Compared with the control group,*P＜0.01.Compared with the model group,#P ＜0.01.Compared with the no-load group,&P ＜0.01.

組別Groups Occludin ZO-1對照組Control group 0.90±0.13△ 0.62±0.10△模型組Model group 0.35±0.07△* 0.20±0.06△*空載組No-load group 0.36±0.08△* 0.19±0.07△*過表達組Over-expression group 0.62±0.10△*#& 0.40±0.08△*#&

3 討論

肝癌具有惡性程度高、發病隱匿、浸潤和轉移性強的特點,目前手術切除、放化療等手段雖可消除病灶或抑制瘤體的發展,但仍有較高的復發、轉移率[8]。 “肝腸軸”概念(機體腸道與肝間的交互作用,前者的紊亂是肝疾病發生的重要原因,腸道的穩態環境對肝的保護及機體內環境的穩定有重要作用)的提出,使肝疾病與腸道的作用受到關注,為肝癌腸轉移機制提供新的切入點[9]。 隨著基因檢測手段的進步,miRNA 在腫瘤發生發展中的作用受到重視,成為腫瘤治療新途徑,了解miRNA 在原發性肝癌中表達的意義及對小鼠腸道微生態環境的影響,可為臨床的治療提供依據。

miRNA 是近年來新發現的一類短小、內源性、非編碼特性的單鏈RNA 分子,全長21 ～25 個核苷酸,在多種真核生物中參與轉錄后的調控表達,其異常表達可影響細胞的增殖、凋亡、分化等重要過程[10-11]。 劉旭斌等[12]認為miRNA 參與肝癌的發生發展；趙立涵等[13]研究發現,miRNA-144-3p 能通過抑制HDGF 基因與蛋白的表達,促進肝癌細胞的凋亡。 本研究結果中,除對照組外,其余3 組小鼠隨著時間的延長,精神狀態變差,毛色欠光滑,進食量、活動量、體重均下降,出現腹瀉及便血,肝組織與結腸組織均有不同程度的破壞,而過表達組較輕；模型組、空載組中癌組織miRNA-144 mRNA 相對表達量低于過表達組。 證實miRNA-144 過表達可抑制肝癌的發展。 腸道黏膜屏障可防止腸腔內有害物質通過腸黏膜進入其他組織及循環中,腸道黏膜屏障功能受損時,腸道內細菌和內毒素可進入門靜脈系統,引起炎癥和免疫反應,進一步加重腸道黏膜損傷并造成遠隔器官損傷。 而肝癌患者因腫瘤細胞的浸潤和轉移,維持表皮和內皮細胞的選擇性滲透屏障功能被破壞,細胞間的緊密連接受損,導致腸道黏膜損傷[14-15]。 王軻等[16]認為,腸道微生態失衡促進肝硬化-肝癌癌前病變的惡性轉變,通過調節腸道菌群,阻止細菌的移位并阻斷相關信號通路,可延緩或阻止肝癌癌前病變的形成和惡性轉變。 本研究結果中,與對照組比較,其余3 組的雙歧桿菌、乳酸菌、shannon 及chao 指數更低,過表達組高于模型組與空載組；與對照組比較,其余3組的大腸桿菌、腸球菌、血清DAO、內毒素OD 值及細菌異位率更高,而過表達組低于模型組與空載組。 以上結果說明miRNA-144 過表達能減輕肝與腸道組織損傷,調節腸道菌群,改善腸黏膜屏障功能。

機械屏障是腸黏膜屏障功能中的重要組成部分,緊密連接和黏附連接是腸道上皮機械屏障功能的重要組成部分[17]。 Occludin 與ZO-1 是緊密連接的主要組成成分,Occludin 蛋白的外形結構及跨膜結構參與腸壁通透性的調節；ZO-1 在緊密連接中起橋梁作用,與ZO-2、ZO-3 形成復合體,通過其PDZ區與Occludin 的羧基端結合,其羧基端與細胞內骨架蛋白結合,是緊密連接的功能蛋白,其表達在上皮細胞滲透性與維持細胞極性中發揮重要作用[18-19]。 李永春等[20]認為,蠟樣芽孢桿菌能改善膽汁淤積肝損傷大鼠的腸黏膜通透性,其機制與上調小腸組織中緊密連接蛋白的表達有關。 王莉[21]認為,黃芩苷能通過調節miRNA,改善TNF-α 誘導的腸上皮細胞通透性,提高靶基因ZO-1 的表達。 本研究結果中,除過表達組外,其余3 組結腸組織的miRNA-144 mRNA 相對表達量均下降,模型組、空載組均低于對照組；除對照組外,其余3 組Occludin、ZO-1 mRNA 及Occludin、ZO-1 蛋白相對表達量均下降。 提示miRNA-144 過表達能上調Occludin、ZO-1 mRNA 和蛋白的表達,從而調節腸道微生態,改善腸黏膜屏障功能。

綜上所述,miRNA-144 過表達,能抑制肝癌的發展,改善小鼠腸道微生態環境與腸道黏膜功能,其調節機制可能與增加Occludin、ZO-1 mRNA 和蛋白的表達有關,可將miRNA-144 作為肝癌基因治療的切入點。