定量核磁共振技術(shù)的測試流程

萬相勇，徐雪晶，徐英杰，趙錦漪，肖 明，馬小芳，楊世龍*

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037;2.南京林業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代分析測試中心，江蘇 南京 210037;)

核磁共振技術(shù)普遍用于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，隨著高強(qiáng)度磁場以及傅里葉變換技術(shù)的應(yīng)用，儀器的各項性能得到極大的改善，使得其應(yīng)用于定量分析成為了可能。定量核磁共振技術(shù)(Quantitative Nuclear Magnetic Resonance，QNMR))是一種通用技術(shù)，只要含1H、19F、13C、31P等原子就可以進(jìn)行定量，與其它定量方法相比，QNMR具有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如，不需要自身的標(biāo)準(zhǔn)品，不需要引入校正因子，對樣品無破壞，定量結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好[1]，因此，近十年，定量核磁工作技術(shù)已廣泛用于制藥、食品、生命科學(xué)、化工等行業(yè)，并被中國藥典、美國藥典、歐洲藥典收錄，已成為一種常用的定量手段。為快速、方便地進(jìn)行QNMR實驗，本文總結(jié)了QNMR的原理、內(nèi)標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)物的選擇、實驗參數(shù)設(shè)置以及實施方法，以期為科研工作提供參考。

1 QNMR的原理

QNMR常用內(nèi)標(biāo)法對化合物進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)法以結(jié)構(gòu)已知的化合物作為內(nèi)標(biāo)物，精確稱量內(nèi)標(biāo)物和待測樣品，用氘代試劑配成混合溶液，選取合適的儀器參數(shù)進(jìn)行測量，通過定量峰的面積比，計算得到待測樣品的含量，計算公式如下[2]：

式中，Px和Pstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物的純度， Ix和Istd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物中定量峰的峰面積，Nx和Nstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物定量峰對應(yīng)的氫原子個數(shù)，Mx和Mstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物的摩爾質(zhì)量，mx和mstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量。

2 實施步驟

QNMR的一般步驟是：首先對待測樣品進(jìn)行表征，對峰進(jìn)行歸屬，選取合適的氘代試劑、內(nèi)標(biāo)物和定量峰，然后將內(nèi)標(biāo)物和被測物質(zhì)準(zhǔn)確稱重，用氘代試劑溶解，放入儀器中，調(diào)節(jié)相關(guān)儀器參數(shù)，進(jìn)行測試，根據(jù)公式計算含量。為進(jìn)一步驗證方法的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化、專屬性、重復(fù)性等相關(guān)實驗。

2.1 氘代試劑的選擇

氘代試劑的選擇，不僅要考慮溶解性能，而且還要考慮到溶劑對化學(xué)位移的影響。主要從以下幾點(diǎn)出發(fā)[3-4]，①溶劑峰與樣品峰要分離。②讓定量峰盡量與其它峰有更大的分離度，必要時可考慮使用混合溶劑，混合試劑可以使在單一試劑中不能完全分離的定量信號得到完全分離，從而達(dá)到單一試劑無法達(dá)到的效果。③注意溫度對氘代試劑的影響，使用易揮發(fā)的溶劑，例如氘代氯仿，不易升溫，以免加快揮發(fā)，影響測試結(jié)果。

2.2 定量峰和內(nèi)標(biāo)物的選擇

定量峰的選擇對測試結(jié)果影響大，在選擇定量峰時，應(yīng)從以下幾方面著手[5]：①定量峰與其它峰分離度要好。②首選單峰，其次選擇帶有裂分的峰。③對于定量氫譜，選擇非活潑氫，定量結(jié)果會更加準(zhǔn)確。

內(nèi)標(biāo)物的選擇除了滿足定量峰的要求外，還需要考慮以下幾點(diǎn)：①內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)與性質(zhì)穩(wěn)定，不與溶劑、樣品等反應(yīng)。②縱向馳豫時間(T1)較短。③內(nèi)標(biāo)物定量峰對應(yīng)的原子核的化合物環(huán)境最好與樣品的相似。④廉價，易得，無毒或低毒。常見的內(nèi)標(biāo)物有苯、苯甲酸、二甲基亞砜、馬來酸等。

總之，定量峰與內(nèi)標(biāo)物的選擇相互配合，各個因素綜合考慮，除上述因素外，最好讓樣品的定量峰與內(nèi)標(biāo)物的定量峰位置相近，且不相互干擾，這樣，測試結(jié)果會更加準(zhǔn)確。

三是還未形成核心服務(wù)產(chǎn)品。Z公司可為入駐企業(yè)提供場地、會務(wù)、安保、保潔、餐飲等基礎(chǔ)服務(wù)，以及人力資源服務(wù)和政策性融資服務(wù)等簡單的增值服務(wù)，但在投融資以及技術(shù)創(chuàng)新等高端的企業(yè)孵化服務(wù)方面的認(rèn)識不夠，未能找到適合入駐企業(yè)及自身切實需求的核心服務(wù)產(chǎn)品。

2.3 主要參數(shù)設(shè)置

由QNMR的計算公式可以看出，影響結(jié)果的主要因素只有峰面積是需要測量的，因此，與儀器參數(shù)設(shè)置密切相關(guān)，影響峰面積的儀器參數(shù)主要有儀器的磁場強(qiáng)度、掃描次數(shù)、馳豫延遲時間、采樣時間、增益值、脈沖程序等[6-7]。

2.3.1 磁場強(qiáng)度

磁場強(qiáng)度是儀器的主要參數(shù)，一般情況下，儀器磁場強(qiáng)度越高，靈敏度越高，分辨率越高，檢測限就可能會很低，更加適用于微量樣品的檢測。通常情況，400MHz以上的核磁共振譜儀用來做QNMR研究就足夠了。

2.3.2 馳豫延遲時間

馳豫延遲時間(D1)是一個重要的參數(shù)，D1主要與化合物中原子的縱向馳豫時間(T1)相關(guān)。在QNMR實驗時，一般要求D1≥5T1，如果D1過短，縱向磁化矢量不能完全恢復(fù)，所收集的峰面積不準(zhǔn)確，就會造成結(jié)果不準(zhǔn)確；但如果D1過長，則造成測試時間很長。因此，獲得合適D1值很重要。實驗前最后測量下T1，從而確定合適的D1值。一般有兩種途徑，第一種，測量精確的T1值，核磁軟件一般帶有測量T1值的功能，可利用軟件進(jìn)行測試。第二種可以采集不同D1值下的圖譜，當(dāng)定量峰峰面積不再變化時，可認(rèn)為此時的D1值為最佳值[8]。此外，對于13C QNMR，由于13C的T1值很大，可加入馳豫試劑，縮短T1值，常用的弛豫試劑為乙酰丙酮鉻[9]。

2.3.3 采樣時間

采樣時間指信號衰減為噪音所用的時間，采樣時間過短，信號未完全衰減即停止采集，則會發(fā)生截尾現(xiàn)象，傅里葉變換后，可能產(chǎn)生錯誤的峰，如果采樣時間過長，譜圖中含有過多的噪音，造成分辨率下降，同時實驗時間過長。

2.3.4 掃描次數(shù)

掃描次數(shù)對提高譜圖的信噪比有很大幫助，掃描次數(shù)越多，信噪比越大，定量結(jié)果也更準(zhǔn)確，但掃描次數(shù)太多，實驗時間較長，1H QNMR、19F QNMR、31P QNMR次數(shù)可以低，一般16～128次，對于13C QNMR掃描次數(shù)可能需要上千次。

2.3.5 其他參數(shù)

影響QNMR的參數(shù)有很多，有些參數(shù)雖然影響不明顯，但如果進(jìn)行優(yōu)化，定量效果會更好，例如，脈沖角度最好選用90°脈沖角。在確保信號不會溢出的情況下，增益值最好選擇最大值并保持一致，以提高信噪比。共振頻率中心最好在樣品和內(nèi)標(biāo)物定量峰之間，以達(dá)到最佳的共振效果。此外，在測試時，采用溶劑峰壓制、旋轉(zhuǎn)樣品等方法，也可以提高信噪比，提高測試準(zhǔn)確度[6]。

2.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理時，不僅要對每張圖譜進(jìn)行仔細(xì)的化學(xué)位移校正、相位校正和基線校正；而且還可以采用其它方法，提高QNMR的準(zhǔn)確度，例如，采用窗函數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以提高信噪比；積分應(yīng)該采用固定范圍的方式進(jìn)行積分，確保積分的準(zhǔn)確性；進(jìn)行沖零操作，可以提高圖譜的分辨率。

3 方法學(xué)驗證

對QNMR方法學(xué)的驗證主要從線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收等方面進(jìn)行考察，考察合格，方能作為定量方法對樣品進(jìn)行測試[10-13]。

3.1 線性關(guān)系

考查線性關(guān)系時，可配制不同濃度的樣品，加入相同濃度的內(nèi)標(biāo)物，同時測定譜圖，以樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)定量峰的面積比為縱坐標(biāo)，以樣品與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制曲線，線性相關(guān)系數(shù)越接近1，線性關(guān)系越好。

3.2 精密度實驗

考查精密度時，制備一個樣品，加入內(nèi)標(biāo)物后，連續(xù)測量5次以上，計算樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)定量峰面積比的RSD值，一般要求RSD<2%。

3.3 重復(fù)性實驗

平行制備5份以上樣品和內(nèi)標(biāo)的混合供試液，同一條件下測定譜圖，根據(jù)兩者定量峰的面積比，計算樣品的濃度，根據(jù)多次計算結(jié)果求出RSD值，一般要求RSD<2%。

3.4 穩(wěn)定性實驗

制備一個含有樣品和內(nèi)標(biāo)物的供試液，每隔一定的時間測定一次譜圖，計算樣品定量峰和內(nèi)標(biāo)定量峰的面積比，并計算RSD，可以得到穩(wěn)定性的結(jié)果，一般要求RSD<2%。經(jīng)上述實驗后，線性關(guān)系好，精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的定量方法才可以用于測定實際樣品。

4 總結(jié)

QNMR技術(shù)集樣品定性與定量于一體，與其它定量方法相比，具有諸多優(yōu)勢，已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。隨著高場核磁和高端軟件的研發(fā)，QNMR技術(shù)在藥物、食品、生命科學(xué)、化工等領(lǐng)域應(yīng)用前景將更加廣泛。故本文綜述了QNMR的原理、內(nèi)標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)物的選擇、實驗參數(shù)設(shè)置及主要方法學(xué)驗證實驗，以期為QNMR實驗提供參考。