黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌固態發酵麩皮工藝優化

張福娟

(朝陽師范高等專科學校 生化工程系，遼寧 朝陽 122000)

0 引言

我國是世界畜牧生產大國之一.隨著畜牧業的發展，人畜共糧矛盾凸顯，環境污染的惡化和農藥抗生素的殘留造成的各種食品安全問題也日益增多，一種能夠緩解這些問題的方法便是研發微生態發酵飼料[1-3].微生態發酵飼料通過菌種發酵產生豐富的酶系和益生菌，減少甚至替代抗生素的使用，降低環境污染，減少農藥殘留，提高動物的生產性能和肉品的安全性，是當前畜牧養殖發展的新趨勢[4-5].目前，微生態發酵飼料多以單一菌種為主，這類發酵方式往往功效小且效果單一.多菌種發酵飼料能夠改善此類問題，但多菌種發酵方式由于受到多菌種之間生長條件的相互制約，發酵過程比較復雜，發酵產物難以控制[6-7]，所以多菌種共同發酵生產飼料是研究難點[8].

本研究中以飼料常用原料麩皮作為主要發酵基質，以黑曲霉和熱帶假絲酵母作為發酵菌劑進行微生態固態發酵飼料實驗，成品最終的粗纖維和粗蛋白含量作為衡量指標，探索微生態固態發酵的最佳工藝參數，為微生態發酵飼料的生產和研發提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料和菌種

麩皮：市售.

黑曲霉和熱帶假絲酵母：均購于中國科學院微生物研究所菌保中心.

1.1.2 藥品

氫氧化鈉、98%硫酸、無水硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、無水乙醇、溴甲酚綠、硼酸、蔗糖、硫酸銨，全部為分析純試劑；石蕊試紙.

1.1.3 儀器與設備

微量凱氏定氮裝置，DHG-914385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海滬粵明科學儀器有限公司)，9052型電熱恒溫培養箱(蘇州江東精密儀器有限公司)，AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(上海予騰生物科技有限公司)，高壓滅菌鍋(上海茸研儀器有限公司)，容量瓶，移液管，酸式滴定管，錐形瓶，電子萬用爐.

1.1.4 培養基

1.1.4.1 PDA固體培養基

取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1000 mL ,80 ℃浸泡1 h，用紗布過濾，然后補足失水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min，即得20%馬鈴薯浸汁，貯存備用.每100 mL馬鈴薯浸汁加入2 g葡萄糖，加熱煮沸后每100 mL馬鈴薯浸汁加入2 g瓊脂，繼續加熱融化并補足失水,分裝，加塞，包扎,高壓蒸汽滅菌(121 ℃滅菌20 min),臥斜，使試管內部液體呈斜面狀態，待冷卻后30 ℃恒溫培養24 h，排除冷凝水，觀察試管培養基表面光滑無菌則可以接菌.

1.1.4.2 PDA液體培養基

馬鈴薯20%，葡萄糖2%.具體制作：取200 g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸30 min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料補足1000 mL水，121 ℃滅菌20 min.

1.1.4.3 麥芽汁培養基

12°Bx 麥芽汁，121 ℃滅菌20 min.

1.1.4.4 固態發酵培養基

裝料：按照一定的含水量對麩皮進行拌料，每kg混合料加入2 mL濃硫酸；裝入三角瓶內(50 g/瓶)，高度20～25 cm；用棉塞堵塞封口，再用16層無菌紗布封口；高壓蒸汽滅菌，100 Pa 滅菌20 min；自然冷卻.

接菌：按照一定的比例將斜面發酵菌株接種至物料上，一定溫度下培養一定時間.

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 菌種活化

將保存的菌種分別接到PDA斜面培養基中，30 ℃恒溫培養 24～72 h，再轉接2～3次，備用.

1.2.1.2 種子液的制備

接種一環經活化后的黑曲霉于PDA液體培養基中，30 ℃恒溫培養 24～72 h；接種一環經活化后的熱帶假絲酵母于麥芽汁液體培養基中，30 ℃恒溫培養 24 h.

1.2.1.3 固態發酵實驗

將制備好的黑曲霉種子液和熱帶假絲酵母種子液按照一定配比混合，按照不同的發酵參數進行組合，開展發酵實驗，每個實驗重復3次.發酵結束后，60 ℃下烘干，測定發酵產物的粗蛋白和粗纖維含量.

1.2.2 測定方法

粗纖維的測定：飼料中粗纖維含量的測定方法[9].

粗蛋白的檢測：采用凱氏定氮法檢測[10].

1.2.3 單因素實驗

將發酵影響因子梯度化設計，其中含水量分別為40%、50%、60%、70%和80%，發酵溫度分別為26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃和38 ℃，發酵時間分別為24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，接種量分別為5%、10%、15%、20%和25%.四個因素、五個水平進行單因素實驗，以粗蛋白和粗纖維含量為衡量指標，確定單因素最佳發酵條件，為正交試驗水平的選取提供主要參考.

1.2.4 正交試驗

以粗蛋白、粗纖維含量為評價指標，依次進行黑曲霉與熱帶假絲酵母比例、發酵溫度、發酵時間和含水量的單因素實驗, 并確定四因素三水平的最佳參數，進行單因素分析.

2 結果與討論

2.1 含水量對發酵底物的影響

從表1可以看出，含水量單因素實驗中黑曲霉固態發酵含水量在40%～70%時，蛋白質含量隨含水量的升高而增加，在70%以上卻又隨含水量的升高而逐漸降低，最優含水量為70%，粗蛋白質含量為22.5569%；粗纖維含量呈現先迅速下降再上升趨勢，含水量70%時粗纖維含量最低，為5.14%.熱帶假絲酵母發酵在含水量40%～70%時，蛋白質含量隨含水量的升高而增加，之后隨著含水量增加蛋白質含量下降，因此最優含水量為70%，粗蛋白質含量為18.5731%，此時粗纖維含量也是最低，為8.34%.所以，正交試驗選取含水量水平參數分別為60%、70%和80%.

表1 不同含水量對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態發酵產物的影響 單位：%

2.2 溫度對發酵底物的影響

從表2可以看出，溫度單因素實驗中黑曲霉固態發酵最優溫度為29 ℃，粗蛋白含量最高，為22.9314%，粗纖維含量最低，為6.40%.熱帶假絲酵母固態發酵蛋白質含量最高、粗纖維含量最低點為32 ℃.所以，正交試驗選取溫度參數分別為29 ℃、32 ℃和35 ℃.

表2 不同溫度對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態發酵產物的影響 單位：%

2.3 時間對發酵底物的影響

從表3可以看出，時間單因素實驗中，黑曲霉固態發酵隨時間的增長粗蛋白含量逐漸增加，粗纖維含量逐漸降低，變化幅度最大是在前期發酵24～48 h，隨后緩慢增長.熱帶假絲酵母也是在24～48 h指標變化幅度最大.可見，兩類菌種發酵活躍期接近，有利于最大發揮效能.正交試驗選取時間水平分別為48 h、60 h和72 h.

表3 不同時間對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態發酵產物的影響 單位：%

2.4 接菌量對發酵底物的影響

從表4可以看出，接菌量單因素實驗中黑曲霉固態發酵最優接菌量為20%，熱帶假絲酵母固態發酵最優接菌量為10%.所以，正交試驗選取接種總量為20%，黑曲霉與熱帶假絲酵母菌種配比分別為2∶1、1∶1和3∶1.

表4 不同接菌量對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態發酵產物的影響 單位：%

2.5 混菌的正交試驗

由表5可見，以粗蛋白含量為衡量指標，得黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌發酵影響次序依次為B>C>A>D，粗蛋白含量最高的最優組合為B2C1A2D3.以粗纖維含量為固態發酵衡量指標，得黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌發酵影響次序依次為B>C>D>A，粗纖維含量越低越符合微生態發酵飼料需要，所以最優組合為B2C1D3A2.兩個衡量指標得到一致的參數組合，這也與理論預期一致.

表5 黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌固態發酵正交試驗檢測結果

3 結論

黑曲霉和熱帶假絲酵母兩菌種組合發酵高產蛋白酶、纖維素酶，提高飼料利用率，即最優參數為：麩皮含水量70%，菌種配比為黑曲霉∶熱帶假絲酵母=2∶1，發酵溫度為32 ℃，發酵時間為72 h.在此工藝參數下固態發酵麩皮，蛋白質含量最高，粗纖維含量最低，符合微生態發酵飼料產品預期.