縊蟶外套膜的組織學和組織化學研究

劉彧成，梁健,2，王培，鄭妮，洪敏 ,郭永軍,2，李永仁,2

（1.天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市海洋牧場技術工程中心，天津 300457）

外套膜分布在兩片貝殼內面，是包裹內臟團的薄膜，其背面與內臟團的上皮組織粘連在一起。外套膜分泌形成貝殼的分泌機理一直是研究熱點。特別是其外側緊貼貝殼的珍珠層，可形成珍珠，長期以來備受青睞?？O蟶Sinonovacula constricta 屬于雙殼貝類，俗稱“蟶子”、“青子”，殼較其他貝類脆，生長較快，是一種重要的養殖貝類[1,2]。關于櫛孔扇貝Chlamys farrei[3,4]、三角帆蚌Hyriopsis cumingii[5]、池蝶蚌Hyriopsis schlegelii[6]、紫彩血蛤Nuttallia olivacea[7]、文蛤Meretrix meretri[8]等貝類的外套膜已有研究，但縊蟶外套膜的組織學和組織化學研究較少。

本研究采用HE 染色等組織學方法研究縊蟶外套膜的組織結構，采用Gomori 鈣-鈷法染色、汞溴酚藍染色和阿利新藍-PAS 染色方法分析其內在化學構成，旨在從組織結構和細胞內主要成分上找到縊蟶與其他貝類的不同點，為解決縊蟶貝殼易破損、運輸中大量死亡等問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用縊蟶取自于天津市王頂堤水產批發市場，平均殼長為（53.24±2.23）mm，暫養于實驗室水箱中，選擇個體完整、規格相近、活力良好的縊蟶作為實驗對象。

1.2 方法

將縊蟶放在解剖盤中，測量和記錄殼長、殼寬、殼高和體質量。用手術刀沿外套膜與貝殼交匯處插入，輕輕滑動解剖刀使外套膜與貝殼分離，用剪刀剪取約1 cm 長的外套膜，用貝類生理鹽水[8]清洗之后，置于固定液中。外套膜組織較薄，為防止固定時發生蜷縮，先將組織放在濾紙上緩慢滴加固定液，再將組織連同濾紙一同放入固定液中固定。

1.2.1 組織學方法

將組織塊在Bouin’s 液中固定12h 后，取出移入70%乙醇中保存備用。脫水劑為叔丁醇，各級脫水時間為1h，常規石蠟包埋，切片厚度6μm，H·E染色，常規方法封片。

1.2.2 組織化學方法

將組織放于Carnoy 氏液中固定，脫水、包埋及切片同上，用改良Gomorri 鈣鈷法顯示堿性磷酸酶（對照組切片于90℃的熱水中處理10min 使堿性磷酸酶失活），AB-PAS 染色法顯示糖類，汞溴酚藍染色法顯示蛋白質，中性樹膠封片。采用Motic BA600-4 數字切片掃描與應用系統高精度掃描切片，用Motic 數字切片助理Lite 1.0 觀察組織，采集圖片。

2 結果與分析

2.1 組織學觀察

組織學觀察顯示，縊蟶外套膜無邊緣膜突起，上、下殼外套膜的邊緣膜直接愈合，有明顯的愈合點（圖版1-ⅰA）。邊緣膜（圖版1-ⅰB）較厚，顏色深，中央膜較薄，近似透明。

2.1.1 邊緣膜

如圖版1-ⅱ所示，邊緣膜顏色深，較厚，由結締組織（C）、肌纖維（D）、外側上皮（E）和內側上皮（F）組成，還分布有粘液細胞（向下箭頭）。

2.1.1.1 外側上皮

靠近縊蟶外殼一側的上皮層被稱為外側上皮，主要由單層柱狀纖毛上皮細胞（圖版1-ⅲ，向右箭頭）組成。細胞核位于底部，呈卵圓形，無粘液細胞分布。

2.1.1.2 內側上皮

靠近縊蟶外套腔一側的上皮層被稱為內側上皮，主要由單層柱狀上皮細胞（圖版1-ⅳ，向左箭頭）組成；內側上皮分布著大量細胞核明顯的粘液細胞。

2.1.1.3 結締組織和肌纖維

上皮層下分布的結締組織十分豐富，主要為疏松結締組織，內分布有較多肌纖維，肌纖維由內環?。▓D版1-ⅴG）和外縱?。▓D版1-ⅴH）組成，主要維持外套膜的伸縮，與外套膜的運動相關。

2.1.2 愈合點

縊蟶上殼和下殼的外套膜已愈合，沒有其他灘涂雙殼貝類所具有的邊緣膜突起，這是縊蟶外套膜的特殊之處（圖版1-ⅵ）。

2.2 組織化學研究

2.2.1 改良Gomorri 鈣鈷法顯示堿性磷酸酶

縊蟶外套膜邊緣膜的外側上皮細胞經改良Gomorri 鈣鈷法顯示為陽性，細胞內含物有棕褐色沉淀，表明該部位有較強的堿性磷酸酶(ALP)活性（圖版2-?。?，對照組縊蟶同一部位的上皮細胞顯示為陰性，細胞內無棕褐色沉淀（圖版2-ⅱ）。而其他部位，實驗組和對照組均顯示為陰性，細胞內無棕褐色沉淀（圖版2-ⅲ和圖版2-ⅳ）。

2.2.2 AB-PAS 染色顯示糖類

縊蟶外套膜的邊緣膜內側和外側上皮細胞都被AB-PAS 染成藍色，說明含有酸性黏蛋白；外套膜邊緣內側的上皮細胞質（圖版2-ⅴ，向上箭頭）被染成淺紫紅色，說明含有少量糖類，分布有中性粘液物質；結締組織和肌纖維PAS 染色呈陽性，被染成紅紫色，染色相對較強，說明糖類含量較多。

2.2.3 汞溴酚藍染色顯示蛋白質

圖版1 縊蟶外套膜組織學觀察（橫切，H·E 染色）Plate 1 Histological observation of mantle membrane of razor clam Sinonovacula constricta （Transversal section,H.E.staining）

圖版2 縊蟶外套膜組織化學觀察Plate Ⅱ Histochemical observation of mantle membrane of razor clam Sinonovacula constricta

汞溴酚藍染色法顯示，縊蟶外套膜的邊緣膜外側上皮細胞染色較深，說明蛋白質含量較多，內側上皮染色較淺，說明蛋白質含量較少。而結締組織染色較淺，說明蛋白質含量較少，肌纖維染色很深，說明蛋白質含量很多（圖版2-ⅵ）。

3 討論

3.1 縊蟶外套膜結構的分析

組織學觀察表明，縊蟶的外套膜主要由邊緣膜和中央膜組成，但組織結構與雙殼貝殼類外套膜基本組織結構的特點有所不同?？O蟶上、下殼外套膜的邊緣膜愈合而無邊緣突起結構，而文蛤[8]、紫彩血蛤[7]等雙殼貝類均有邊緣膜、中央膜和邊緣膜突起結構。

3.2 縊蟶外套膜粘液細胞的分布

H·E 染色表明，縊蟶外套膜內、外側上皮分別為柱狀纖毛上皮和柱狀上皮，外側上皮細胞間分布一定量的粘液細胞。邊緣膜的外側為單層柱狀纖毛上皮，外側上皮染色比內側上皮深，因為內側細胞內有大量的粘液細胞，可以分泌大量粘液物質，說明位于內側上皮的細胞有一定的分泌功能。邊緣膜上皮下有大量泡狀疏松結締組織，其中還分布有大量肌纖維。縊蟶外套膜中含有較多粘液細胞，但是，外套膜不同部位粘液細胞的數量不同，形態也不盡相同。對櫛孔扇貝和文蛤的研究發現，外套膜和鰓絲等部位受水流沖擊影響較大，含有較多的粘液細胞[10,11]。縊蟶的外套膜中也含有大量粘液細胞，主要分布在外套膜的內側上皮細胞間，而且在邊緣膜處較密集。推測縊蟶的外套膜中粘液細胞的分布情況與外界接觸情況有關，即接觸越頻繁粘液細胞的數量越多。

3.3 縊蟶外套膜中化學物質的分布

組織化學方法顯示，在外套膜邊緣膜外側上皮細胞中堿性磷酸酶(ALP)活性較強，其余各部位均無明顯反應。背角無齒蚌Anodonta woodiana elliptica外套膜的表皮細胞中，堿性磷酸酶反應很強，結締組織中只有游走細胞為陽性，其余細胞為陰性，肌細胞活性不明顯[12]。AB-PAS 染色法顯示：縊蟶外套膜的邊緣膜內、外側上皮均具較少糖類，結締組織和肌纖維中含有大量糖類。紫彩血蛤外套膜中，外側上皮含糖量多[6]。汞溴酚藍染色顯示蛋白質法的研究結果則表明，縊蟶外套膜內側上皮和肌纖維蛋白質含量少，外側上皮和結締組織蛋白質含量多。海灣扇貝Argopecten irradians 外套膜同樣也富含蛋白質，但是肌纖維和上皮組織含量多，結締組織中含量少[13]。

3.4 小結

縊蟶上、下殼外套膜的邊緣膜愈合，無邊緣突起結構?？O蟶的外套膜中粘液細胞的分布與外界接觸有關，即接觸越頻繁粘液細胞分布數量越多。糖類大多分布于結締組織和肌纖維中，上皮層中分布較少；蛋白質大多分布于外側上皮和結締組織中，內側上皮和肌纖維中分布較少。