蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2特異性抑制劑PHPS1通過促進泡沫細胞形成加速apoE-基因敲除小鼠早期動脈粥樣硬化進展

馬 倩，路永剛，李新新，譚 鶴，朱學燦，帖彥清*

(1.河北省人民醫院檢驗科，河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫院組織人事處，河北 石家莊 050051)

高脂血癥是導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的首要因素，血液中過多的脂質沉積于血管分叉處促使AS形成。血液循環中的單核/巨噬細胞被募集至AS易損血管部位，吞噬血管內脂質成分形成泡沫細胞，進而分泌多種受體如白細胞分化抗原36(cluster of differentiation36，CD36)和清道夫受體A1(scavenger receptorA1，SR-A1)，Toll樣家族受體2(Toll-like receptors，TLR-2)和Toll樣家族受體4(Toll-like receptors，TLR-4)、炎癥因子、蛋白酶等破壞斑塊結構、加速AS進展，所以如何控制泡沫細胞形成是治療AS主要和重要的切入點[1-3]。酪氨酸磷酸酶SHP-2(protein-tyrosine phosphatase SHP-2，SHP-2)參與了胚胎發育、細胞代謝、增殖、凋亡等生理過程。目前關于SHP-2在AS機制中的作用研究尚處于起步階段。在分子水平上，SHP2主要參與眾多生長因子和細胞因子及整合素受體下游的眾多信號通路的調控，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase /protein kinase B，PI3K/AKT)是細胞中重要的信號傳導通路，主要調控細胞的增殖、分化、凋亡、轉移等過程[4-6]。在AS的發病過程中，細胞外信號調節酶(extracellular-regulated kinases，ERK)與PI3K/AKT通路參與泡沫細胞的形成[7-9]，是SHP-2調控的重要分支[10-12]。本研究采用氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)和苯肼基吡唑啉酮磺酸鹽1(phenylhydrazono pyrazolone sulfonate 1，PHPS1)共刺激，從體外和體內實驗2個層面，以斑塊成分巨噬細胞為角度觀察SHP-2被PHPS1抑制后對AS進展的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及藥物處理 6～8周雄性apoE-/-小鼠購自常州卡文斯實驗動物公司，所有小鼠飼養于河北省人民醫院無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級環境中，室溫保持在(22±0.2) ℃, 給予1.25%膽固醇高脂飼料飼養，不限食水，隨機分為對照組和PHPS1(1.0 mg/kg)處理組，每組14只，對照組體重17.9～22.9 g，平均(20.14±2.06) g，PHPS1處理組體重18.2～23.4 g，平均(20.23±1.97) g，均以腹腔注射為給藥方式，每日注射0.2 mL，飼養4周后解剖觀察。2組體重差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。因單只小鼠取材量少，不能滿足組織學和分子生物學的實驗對樣本量的要求，而同一組動物之間各種條件相同，故把同組小鼠合并取材，以避免組內動物之間的偏倚，保證足夠的樣本量，所以此研究中每次實驗最終每組樣本例數并非均為14。

1.2實驗試劑和儀器設備 ox-LDL購自廣州奕源生物有限公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)及PHPS1購自Sigma-Aldrich公司，單分散熒光微球(聚苯乙烯微球，polysciences公司)，鼠抗β-actin抗體、鼠抗ERK抗體、鼠抗PI3K及AKT抗體購自proteintech公司，磷酸化-PI3K和AKT購自CST公司，DreamTaqTMGreen PCR Master Mix(2X) 及Trizol試劑盒購自寶生物技術(北京)有限公司，冷凍高速離心機購自賽默飛世爾科技有限公司，Epoch CHS酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司，正置顯微鏡購自Carl Zeiss公司，石蠟切片機購自Leica 公司，體視解剖顯微鏡購自Leica 公司，蛋白印跡法(Western blot)電泳儀、電轉移槽及電源購自北京六一生物科技有限公司，全自動凝膠成像系統購自Syngene公司，全自動熒光PCR分析儀(cobas z480)購自羅氏公司，細胞培養箱購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3引物設計與合成 引物由上海生物工程公司合成，引物序列見表1。

表1 GAPDH,CD36,SR-A,TLR-2,TLR-4引物序列Table 1 Primer sequeces of GAPDH,CD36,SR-A,TLR-2,TLR-4

1.4小鼠解剖及降主動脈整體、主動脈根部切片染色 給予PHPS1處理4周后，水合氯醛腹腔麻醉apoE-/-小鼠后，眼球取血留血清。檢測2組小鼠血清血脂和血糖水平。剖開腹腔和胸腔后，從左心室灌注冰生理鹽水后分離出雙側頸動脈-主動脈弓-胸主動脈-腹主動脈直至髂總動脈分叉處，4%多聚甲醛固定，在體視解剖顯微鏡下縱行剖開，針灸針固定兩側，油紅O工作液染色30 min后，用75%乙醇沖洗，解剖顯微鏡下拍照。4%多聚甲醛固定小鼠心臟，酒精梯度脫水做蠟塊并連續切片，分別做蘇木精-伊紅(hematoxylineosin staining，HE)、抗MAC-2標記免疫組織化學染色、抗α-actin標記免疫組織化學染色和天狼星紅染色，正置顯微鏡拍照評估斑塊大小、斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞和膠原成分含量。

1.5骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)培養及PHPS1、熒光微球、ox-LDL共刺激 ①6～8周雄性SPF級C57 BL-6J小鼠腹腔注射麻醉后，放置于75%乙醇中，在細胞超凈臺中無菌條件下分離股骨和脛骨，剪去雙側股骨和脛骨兩端后用1.0 mL無菌注射器注射1640培養基沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，10 000 r/min離心5 min，下層細胞飼養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%雙抗、50 μg/L 巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)的1640培養基重懸，計數后鋪至T25培養瓶中，5%CO237 ℃培養。②用胰酶消化貼壁的BMDM制成細胞懸液，將無菌細胞爬片放置于六孔板底部，滴加500 μL細胞懸液，置于5% CO2細胞培養箱孵育2 h，使BMDM貼于細胞爬片上；每孔加1 200 μL 2% FBS培養基，繼續孵育8 h；每孔加0.25 μL的ox-LDL(終濃度為50 μg/L)和1 μL的單分散熒光微球加或不加PHPS1刺激16 h，激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.6Western blot分析 在液氮中研磨降主動脈，放置于無線免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液中裂解血管組織30 min，4 ℃高速離心15 min，2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量法測濃度。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜至聚偏氟乙烯(Poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃冰箱中一抗孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液充分洗滌，加相應二抗室溫孵育1 h，增強化學發光法顯色，化學發光凝膠成像系統顯影，IPP 6.0軟件行灰度掃描分析, 以β-actin為內參校正目的蛋白表達量。

1.7逆轉錄實時定量PCR(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測CD36和SR-A1的mRNA水平 提取細胞總RNA逆轉錄為互補DNA(complementary DNA，cDNA)，qRT-PCR檢測CD36和SR-A1基因相對表達量。PCR反應體系DreamTaqTMGreen PCR Master Mix(2X)12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，30個循環后68 ℃ 45 s。△△CT法計算目標基因相對表達量。

1.8觀察指標 比較2組小鼠血清血脂和血漿水平、動脈斑塊大小和內容物、BMDMs內熒光強度、CD36、SR-A1、TLR-和TLR-4的mRNA表達量、磷酸化細胞外信號調節酶(phosphorylated extracellular-regulated kinases，p-ERK)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)蛋白含量。

1.9統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組小鼠血清血脂和血糖水平的比較 2組甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和血糖(blood glucose，GLU)差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 2組小鼠血清血脂和血糖水平的比較Table 2 Comparison of serum lipid and blood glucose levels between two groups of mice

2.22組小鼠動脈斑塊大小和內容物的比較 PHPS1組斑塊內油紅O面積、斑塊大小、斑塊內巨噬細胞含量比對照組顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.01)，2組斑塊內平滑肌細胞和膠原含量差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3，4，圖1，2。

表3 2組小鼠動脈油紅O陽性面積/降主動脈總面積的比較Table 3 Comparison of arterial oil red O positive area/total area of descending aorta between two groups of mice

圖1 PHPS1對apoE-/-小鼠AS斑塊大小的影響作用
Figure1The impacts of PHPS1on the areas of atherosclerotic plaques of apoE-/-mice

圖2 PHPS1對apoE-/-小鼠斑塊內容物的影響作用
A.對照組HE染色；B.對照組抗MAC-2標記免疫組織化學染色；C.對照組抗α-actin標記免疫組織化學染色；D.天狼星紅染色；E.PHPS1組HE染色；F.PHPS1組抗MAC-2標記免疫組織化學染色；G.PHPS1組組抗α-actin標記免疫組織化學染色；H.PHPS1組天狼星紅染色
Figure2TheeffectsofPHPS1onthelesionalcellularcomponentsofapoE-/-mice

表4 2組小鼠動脈斑塊內容物比較Table 4 Comparison of the contents of arterial plaque between two groups of mice

2.32組BMDMs內熒光強度比較 PHPS1組巨噬細胞內部綠色熒光強度比對照組顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5，圖3。

表5 2組BMDMs內熒光強度比較Table 5 Comparison of fluorescence intensity between two groups of BMDMs

圖3 2組BMDMs內熒光強度比較
A.對照組；B.PHPS1處理組
Figure3ComparisonoffluorescenceintensitybetweentwogroupsofBMDMs

2.42組CD36、SR-A1、TLR-2和TLR-4的mRNA表達量的比較 PHPS1組CD36和SR-A1的mRNA表達量比對照組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，2組TLR-2和TLR-4的mRNA表達量差異均無統計學意義(P>0.05)，見表6。

2.52組p-ERK、p-PI3K、p-AKT的比較 PHPS1組p-ERK、p-PI3K、p-AKT蛋白含量比對照組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表7，圖4。

表6 2組CD36、SR-A1、TLR-2和TLR-4的mRNA表達量的比較Table 6 Comparison of mRNA expression of CD36,SR-A1,TLR-2 and TLR-4 between two groups

表7 2組p-ERK、p-PI3K、p-AKT蛋白含量的比較Table 7 Protein expression of p-ERK、p-PI3K、p-AKT between two groups

圖4 2組p-ERK、p-PI3K、p-AKT蛋白含量的比較
Figure4Protein expression of p-ERK、p-PI3K、p-AKT between2groups

3 討 論

蛋白酪氨酸磷酸酶和激酶是維護機體、器官、細胞、信號通路的重要平衡系統，其失衡會導致多種疾病如癌癥、心血管等重大常見疾病的發生，SHP-2是主要的磷酸酶家族成員，也是具有多種細胞功能的決定性蛋白，全身敲除SHP-2小鼠會導致胎鼠死亡[13]。SHP-2特異性抑制劑/化合物PHPS1可特異性與SHP-2活性位點結合從而抑制SHP-2的功能，且PHPS1經濟易得，是研究SHP-2功能的理想工具。本研究采用用PHPS1和apoE-/-小鼠[4-5，13]。AS是由高脂血癥啟動的免疫炎癥性疾病，是由高脂、高糖血癥、抽煙、應激等多種因素導致血液循環中的修飾后脂質成分如氧化型、乙酰化、羧基化低密度脂蛋白、高遷移率族蛋白B1等顯著增多，沉積于AS傾向性血管上(對于血管而言相當于異物入侵)，從而激活固有免疫系統的單核細胞進入血管內部分化為斑塊內巨噬細胞，這些巨噬細胞主要通過清道夫家族受體識別和吞噬上述脂質成分后形成泡沫細胞；其病理表現為大量泡沫細胞出現在血管內皮細胞下，構成初期斑塊特征[14-16]。因此泡沫細胞形成越多，早期AS進展越快。由此可見，PHPS1影響泡沫細胞的形成程度決定了AS的進展程度。用油紅O對降主動脈整體和主動脈根部AS內部泡沫細胞含量的評估表明，PHPS1加速AS進展；對斑塊內容物評估的結果顯示，斑塊內主要為巨噬細胞源性巨噬細胞，其余成分如內皮細胞、平滑肌細胞和膠原成分極少，猜測PHPS1是通過影響巨噬細胞的功能進而加速AS進展的。本研究結果顯示PHPS1并未影響apoE-/-小鼠血糖和血脂水平，提示并非是血脂啟動因子影響PHPS1對泡沫細胞的形成。

本研究以PHPS1和ox-LDL干預BMDMs開展體外機制探討，以綠色熒光微球為標記物通過激光共聚焦拍照后觀察進入BMDM內部的微球數量，結果顯示PHPS1顯著增加了巨噬細胞的吞噬功能。既往的研究發現清道夫家族尤其是CD36、SR-A1、TLR-2和TLR-4是識別并介導ox-LDL內化、進入胞漿的主要受體類型，本研究結果顯示PHPS1組CD36和SR-A1的mRNA表達量比對照組顯著升高(P<0.01)，但2組TLR-2和TLR-4的mRNA表達量差異均無統計學意義(P>0.05)。既往的研究表明SHP-2經ERK和PI3K/AKT通路發揮作用，但基于不同細胞、不同刺激會導致活性不同，提示SHP-2蛋白作用的復雜性，目前尚未見SHP-2抑制后ox-LDL對巨噬細胞的ERK及PI3K/AKT活性的報道[16-19]，本研究結果PHPS1組p-ERK、p-PI3K、p-AKT蛋白含量比對照組顯著升高(P<0.01)，表明SHP-2通過影響ERK及PI3K/AKT通路蛋白的活性抑制巨噬細胞源性泡沫細胞形成，從而抑制早期AS進展。