3種常規(guī)結(jié)核分枝桿菌及耐藥突變檢測方法的對比研究

薛建昌，邸紅芹，吳海峰，鄭 浩，鄭立恒，梁冰鋒

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫(yī)院分子生物室，河北 石家莊 050041；3.河北省胸科醫(yī)院超聲室，河北 石家莊 050041；4.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理系，河北 石家莊 050091)

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的十大原因之一，也是單一傳染源導(dǎo)致死亡的主要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)估計，世界上約有四分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，且耐藥結(jié)核病是威脅公共衛(wèi)生的重大問題，幾乎占全球耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)的一半，中國以13%耐藥比例位列第2，耐藥形勢十分嚴峻[1-2]。結(jié)核病的耐藥性監(jiān)測對于指導(dǎo)合理使用抗生素起著至關(guān)重要的作用，由于傳統(tǒng)的結(jié)核菌培養(yǎng)聯(lián)合抗結(jié)核藥物的敏感性試驗(藥敏試驗)仍是目前診斷結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的“金標準”，但確診周期較長，不利于結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的防控[3-4]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對MTB核酸及異煙肼、利福平等抗結(jié)核藥物基因突變進行快速檢測逐漸被廣泛接受。WHO推薦的Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)(Xpert法)采用實時熒光定量核酸擴增技術(shù)，可以及時快速對樣本中的MTB核酸進行提取和檢測，同時報告待檢樣本中MTB的利福平耐藥情況[5-7]。MTB核酸檢測(PCR-熒光探針法)能快速有效對樣本中的MTB進行檢出，MTB耐藥基因檢測(DNA微陣列芯片法)對檢出的陽性樣本中MTB的異煙肼和利福平耐藥情況能夠快速準確進行檢測，具有較好的臨床應(yīng)用價值[8-9]。本研究對Xpert法、BD960液體快速培養(yǎng)法(BD960法)聯(lián)合快速藥物敏感試驗(藥敏試驗)、MTB核酸檢測(TB-DNA法)聯(lián)合MTB耐藥基因檢測法(DNA芯片法)進行比較，分析不同方法檢測MTB及耐藥情況的效能，評估其在結(jié)核病及耐藥結(jié)核病控制中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年7月—2019年6月在河北省胸科醫(yī)院就診的經(jīng)臨床明確診斷為肺結(jié)核患者246例，男性167例，女性79例，年齡15～86歲，平均(43.90±19.69)歲。患者標本包含痰標本143例，支氣管肺泡灌洗液103例，所有標本均進行MTB鑒定，鑒定方法分別為BD960法、Xpert法和TB-DNA法。所有進行MTB鑒定陽性標本均對應(yīng)進行耐藥情況分析，對應(yīng)方法包括藥敏試驗、Xpert法和DNA芯片法。其中部分樣本參照實驗室標準操作規(guī)程和試劑說明書進行了萋-尼抗酸染色、抗酸染色涂片檢查(夾層杯法)及纖維支氣管鏡刷片抗酸染色檢測。

1.2檢測方法

1.2.1BD960法聯(lián)合藥敏試驗 嚴格參照使用說明書進行操作，BD960法，試驗標本均用1～2倍體積4%NaOH溶液消化15～20 min，加入無菌磷酸鹽緩沖液混勻后離心，棄上清液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀物，混勻后取0.5 mL接種于MGIT960液體快速結(jié)核菌培養(yǎng)基中，放入BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)(Becton Dickinson公司，美國)中進行培養(yǎng)。藥敏試驗根據(jù)CLSI M24-A微量肉湯稀釋法原理，將藥物包括菌群分類藥物事先包被在U-底板上，將結(jié)核菌研磨比濁為1麥氏單位，以培養(yǎng)基稀釋后加入測試孔，根據(jù)各孔的培養(yǎng)結(jié)果獲得MIC數(shù)據(jù)成界值范圍，以此判斷藥物敏感性。

1.2.2Xpert法 按照使用說明書進行操作，加入樣本處理液，充分混勻后，室溫孵育15 min，使用新的移液管將2 mL混合液加入試劑匣(Cepheid產(chǎn)品，美國)，最后放入檢測模塊中進行上機檢測。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察測試結(jié)果。MTB數(shù)量以MTB DNA拷貝分為高、中、低(極低)和未檢出進行報告，利福平檢測結(jié)果為敏感和耐藥。

1.2.3MTB核酸檢測聯(lián)合MTB耐藥基因檢測 樣本中加入1～2倍體積的4%NaOH前處理液，充分搖勻后，室溫孵育15～20 min。取液化后標本1 mL加入1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min。棄上清液，沉淀中加入1 mL清洗液混勻，12 000 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌1次。棄上清液，加入50 μL已混勻的DNA提取液，用移液器充分混勻后轉(zhuǎn)入核酸提取管。將核酸提取管放入振蕩器中，最高速率震蕩10 min。震蕩完成后，將核酸提取管進行95 ℃ 5 min加熱孵育。加熱后12 000 r/min離心5 min，上清即為核酸樣本。參照分枝桿菌檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，成都博奧晶芯生物科技有限公司)說明書進行PCR。MTB核酸檢測報告陽性的核酸樣本，參照MTB耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法，成都博奧晶芯生物科技有限公司)說明書進行耐藥基因檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。檢測結(jié)果一致性采用Kappa檢驗分析，Kappa值<0.4為一致性較差，Kappa值0.4～0.75為中度一致，Kappa值>0.75為高度一致。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同檢測方法對臨床樣本中MTB陽性檢出率比較 BD960法的MTB陽性檢出率低于分枝桿菌核酸檢測和Xpert 法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。對于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測及鑒定方法，其中部分樣本還進行了萋-尼抗酸染色、抗酸染色涂片檢查(夾層杯法)及纖維支氣管鏡刷片抗酸染色檢測，均是直接對樣本中MTB進行病原學(xué)染色觀察。萋-尼抗酸染色檢測陽性率為47.69%(31/65)，抗酸染色涂片檢查(夾層杯法)檢測陽性率為80.10%(161/201)，纖維支氣管鏡刷片抗酸染色檢測陽性率為40.63%(39/96)。3種病原學(xué)染色陽性檢出率均顯著低于BD960液體快速培養(yǎng)法(χ2=61.361，9.279，94.059，P<0.05)、MTB核酸檢測法(χ2=118.490，39.008，152.980，P<0.05)和Xpert法(χ2=144.471，53.767，175.275，P<0.05)，因3種病原學(xué)染色陽性檢出率未達預(yù)期，文中不作進一步分析。

表1 3種方法檢測MTB陽性檢出率比較Table 1 Comparison of the positive detection rate of three methods for detecting MTB (n=246，例數(shù)，%)

*P值<0.05與BD960法比較(χ2檢驗)

2.2不同檢測方法對臨床樣本中MTB耐藥檢出率比較 3種方法對利福平耐藥檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 3種方法對利福平耐藥檢出率比較Table 2 Comparison of the detection rates of resistance to rifampicin by three methods (例數(shù)，%)

以快速藥物敏感試驗檢測結(jié)果作為檢測“標準”，進一步分析Xpert 法和MTB耐藥基因檢測的檢測效能，敏感度分別為95.65%(44/46)和91.30%(42/46)，特異度分別為93.57%(160/171)和95.32%(163/171)，陽性預(yù)測值分別為80.00%(44/55)和84.00%(42/50)，陰性預(yù)測值分別為98.77%(160/162)和97.60%(163/167)，準確度分別為94.01%(204/217)和94.47%(205/217)，約登指數(shù)分別為89.22%和86.63%，均在80%以上。

為保證分析結(jié)果的可比性與準確性，已剔除BD960液體快速培養(yǎng)法和分枝桿菌核酸檢測MTB為陰性的樣本。以快速藥敏試驗檢測結(jié)果作為檢測“金標準”，Xpert 法和MTB耐藥基因檢測利福平耐藥結(jié)果高度一致，Kappa值分別為0.833和0.840(均P<0.05)，見表3。

表3 3種利福平耐藥檢測方法一致性分析Table 3 Analysis of consistency results of three methods for detection of rifampicin resistance (n=217，例數(shù))

快速藥物敏感試驗和MTB耐藥基因檢測能對常規(guī)一線抗結(jié)核藥物——異煙肼耐藥情況進行檢測，結(jié)果顯示，2種方法異煙肼耐藥結(jié)果檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 異煙肼耐藥檢測方法檢出結(jié)果差異分析Table 4 Analysis of the difference in detection results of isoniazid resistance (例數(shù)，%)

3 討 論

MTB尤其是耐藥MTB的產(chǎn)生與傳播是導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病率居高不下的重要原因之一。目前MTB的細菌學(xué)檢測仍是結(jié)核病診斷、治療的重要依據(jù)，萋-尼抗酸染色、電子支氣管鏡刷片抗酸染色及抗酸染色涂片檢查(夾層杯法)檢測是目前實驗室常規(guī)直接對樣本中MTB進行病原學(xué)染色觀察的方法，本研究中萋-尼抗酸染色和纖維支氣管鏡刷片抗酸染色陽性檢出率僅為47.69%(31/65)和40.63%(39/96)，抗酸染色涂片檢查(夾層杯法)陽性檢出率為80.10%(161/201)，與文獻報道的操作簡單快速但陽性檢出率和敏感度不高結(jié)果一致[10-12]。

Xpert法是集樣本處理、核酸提取和擴增、MTB核酸特異性檢測及利福平耐藥基因rpoB突變檢測于一體的結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核病快速診斷方法[13-14]。研究顯示，PCR-熒光探針法可快速檢測樣本中是否含有MTB，具有臨床推廣應(yīng)用價值[15]。本研究結(jié)果顯示，BD960法對MTB的陽性檢出率低于MTB核酸檢測和Xpert法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進一步分析陽性檢出率差異發(fā)現(xiàn)，BD960法報告的9.76%(24/246)MTB陰性結(jié)果中，在Xpert檢測結(jié)果中MTB帶菌量低(極低)占79.17%(19/24)，帶菌量中占16.67%(4/24)，帶菌量高占4.16%(1/24)；MTB核酸檢測法報告的2.03%(5/246)MTB陰性結(jié)果中，Xpert法檢測MTB帶菌量低(極低)占80.00%(4/5)，帶菌量中占20.00%(1/5)，這些中、低濃度帶菌量的樣本是造成陽性檢出差異的主要原因。因此，MTB核酸檢測和Xpert法更有利于結(jié)核病的診治和預(yù)防，但是需要專業(yè)熟練地操作、配套使用的儀器和試劑盒，限制了其在地方性醫(yī)院的推廣。

目前，多重耐藥和廣泛耐藥結(jié)核病仍以MTB耐藥性測試或抗菌藥物敏感性測試為主。本研究結(jié)果顯示，3種方法利福平耐藥檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以快速藥物敏感試驗檢測結(jié)果作為檢測“金標準”，Xpert法和MTB耐藥基因檢測利福平耐藥結(jié)果高度一致(Kappa值均大于0.75)，敏感度、特異度、陰性預(yù)測值和準確度均大于90%，陽性預(yù)測值和約登指數(shù)均在80%以上，與以往的研究報道結(jié)果一致[7,16]。此外，快速藥物敏感試驗及MTB耐藥基因檢測還能夠?qū)颖局挟悷熾履退幥闆r進行分析，結(jié)果顯示，2種檢測方法結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與文獻報道結(jié)果一致[17]。

研究過程中發(fā)現(xiàn)一些造成差異的可能原因，當臨床樣本中MTB帶菌量低(極低)時，BD960快速培養(yǎng)和MTB核酸檢測因最低檢測限閾值問題造成結(jié)果易產(chǎn)生“假陰性”；當樣本中野生型模板背景較高時，易產(chǎn)生非特異性擴增的“假陽性”，同時Gene Xpert技術(shù)在檢測樣本帶菌量極低時，可能會出現(xiàn)假耐藥的情況；表型耐藥與基因型突變會存在一定差異，基于基因突變并不能完全涵蓋所有突變位點的檢測，樣本中MTB濃度低時無法進行MTB耐藥基因檢測等[18-19]。因此，在實際臨床應(yīng)用中需結(jié)合表型和基因型檢測方法，提高檢測敏感度和特異度，以提高準確預(yù)測耐藥性和耐藥結(jié)核病治愈的可能性。

綜上所述，Xpert法和MTB核酸檢測能夠快速準確地對樣本中是否含有MTB進行檢測，快速藥物敏感試驗、MTB耐藥基因檢測和Xpert法能夠?qū)颖局欣Ｆ?異煙肼)耐藥情況進行分析，且MTB耐藥基因檢測和Xpert法具有較高的敏感度和特異度，可結(jié)合實際需求在耐多藥結(jié)核病防治中推廣和應(yīng)用。