SD大鼠心臟結構和功能增齡性改變及與炎癥因子表達的相關性

劉海娘 付浩燃 于勤

(1大連大學,遼寧 大連 116001；2大連大學附屬中山醫院循環三科)

自然衰老與心血管疾病的發生、發展有密切聯系。臨床研究顯示增齡本身是心臟結構改變、功能減退的獨立危險因素〔1〕。心力衰竭(簡稱心衰)是近年來臨床常見的心血管疾病，主要的病理改變是心肌細胞的肥大和間質的纖維化，臨床表現為心臟功能不全〔2,3〕。流行病學資料顯示〔4,5〕，心衰主要發生于高血壓、心臟結構和功能異常的老年患者，且隨著年齡的增加，心衰的發病人數在不斷增加。心血管疾病，尤其是心衰初始的發生發展往往和心肌炎密切相關，炎癥因子的大量表達會加劇心臟結構的病理改變〔6～8〕。目前，關于心臟結構和功能隨著年齡的增加如何改變，其改變與炎癥因子表達的關系如何未見相關報道。本研究將探究SD大鼠隨著月齡的增加，其心臟結構和功能的改變，同時分析其與炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α表達的相關性。

1 材料與方法

1.1試劑材料 TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國博士德生物工程有限公司，兔抗鼠多克隆TNF-α抗體購自中國萬類科技生物有限公司和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自中國碧云天生物技術研究所，Masson試劑購自安特捷生物有限公司。

1.2動物及分組 清潔級雄性SD大鼠，體重350～550 g，購于大連醫科大學實驗動物中心，適應性喂養2 w，予正常飲食飲水。30只大鼠根據月齡分為3 組：6月齡組、18月齡組和26月齡組，每組10只。整個實驗方案經過大連大學倫理委員會討論通過。

1.3超聲心動圖測定心臟大小和心功能 采用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠麻醉生效后，以5%硫化鈉進行脫毛處理，取仰臥位，采用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，12.0 MHz的高頻探頭，行心功能參數測量。選擇M型超聲經胸骨左緣左室長軸切面測量左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)，同時儀器系統自動計算左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)值。其中LVFS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%，LVEF則按照Teichholz公式〔9〕。采用彩色多普勒超聲于心尖四腔切面取二尖瓣口正向血流頻譜，測量二尖瓣舒張早期血流速度峰值(E)和二尖瓣舒張晚期血流速度峰值(A)；組織多普勒超聲于心尖四腔切面取二尖瓣環頻譜，測量二尖瓣環舒張早期運動速度峰值(E′)，并計算E/A和E/E′。上述心臟超聲參數的獲取均由專業的超聲醫生完成操作，每只大鼠測量3個心動周期，取平均值。

1.4血清TNF-α的測定 超聲完成后，從大鼠的腹主動脈抽出血液約2 ml放入4℃冰箱中靜置過夜，3 000 r/min 離心10 min 分離血清，吸取上清液保存于EP管。根據ELISA試劑盒說明書測定各組大鼠血清中TNF-α含量。

1.5免疫組化測定心肌組織中TNF-α含量 處死大鼠后開胸取出心臟，取左室心肌組織行常規石蠟包埋和組織切片，片厚4 μm，行免疫組化檢測心肌組織TNF-α的表達。顯微鏡下觀察免疫組化染色切片，TNF-α陽性表達顯示為棕黃色。左室心肌組織TNF-α含量的評價：每組動物取5張切片，每張切片取5個高倍視野，用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件分析，計算出TNF-α陽性表達百分比，即棕黃色陽性表達面積占整個心肌組織面積的百分比，取測量的平均值比較。

1.6Masson 染色檢測膠原的含量 同1.5中組織切片后，行Masson 三色染色法觀察心肌纖維化的程度。顯微鏡下觀察Masson 染色切片，膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。左室心肌間質纖維沉積的評價：每組動物取5張切片，每張切片取5個高倍視野，用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件分析，計算出膠原容積分數(CVF)，即膠原纖維面積占整個心肌組織面積的百分比，取測量的平均值比較。

1.7心肌超微結構的觀察 麻醉后立即開胸取出心臟，迅速取左心室前壁心肌，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 的小塊狀，立即浸入2.5 %的戊二醛復方固定液中，標本送檢于大連醫科大學電鏡實驗中心，使用透射電子顯微鏡(JEM-2000EX,JEOL,Japan)觀察不同組別心肌組織的超微結構。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析，同時采用雙變量Pearson分析進行相關性分析。

2 結 果

2.1心臟結構 與6月齡大鼠比較，18月齡和26月齡大鼠LVESD、LVEDD逐漸增大，IVSD逐漸增厚，8月齡LVEDD、IVSD與6月齡組比較差異有統計學意義(P<0.05)，26月齡LVEDSD、LVEDD、IVSD與6月齡大鼠比較差異有統計學意義(P<0.05)，26月齡LVEDD與18月齡比較差異有統計學意義(P<0.05)。隨著年齡的增加LVEF、LVFS逐漸降低，與6月齡和18月齡大鼠相比，26月齡大鼠LVEF、LVFS顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。 見表1和圖1。

表1 不同月齡大鼠M型超聲參數變化

與6月齡組比較:1)P<0.05;與18月齡組比較:2)P<0.05，下表同

圖1 不同月齡大鼠心臟結構變化 M型超聲

2.2心臟功能 與6月齡大鼠比較，18月齡和26月齡大鼠心臟舒張功能逐漸變差，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同月齡大鼠心臟多普勒參數變化

2.3左室心肌組織Masson染色 6月齡大鼠心肌組織基本無膠原增生，其心肌組織CVF為(1.39±0.19)%；18月齡大鼠心肌組織中膠原纖維與6月齡組比較明顯增生(P<0.05)，其心肌組織CVF為(3.03±0.63)%；26月齡大鼠〔心肌組織CVF為(7.92±0.47)%〕與18月齡及6月齡相比心肌組織中膠原纖維均有顯著增生，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同月齡大鼠左室心肌組織(Masson染色，×200)

2.4各組大鼠左室心肌組織超微結構 6月齡大鼠的心肌細胞結構清晰，肌原纖維排列整齊，肌節完整，Z 線結構清晰，線粒體嵴結構清晰；18月齡大鼠心肌細胞略有腫脹，肌原纖維結構排列基本整齊，Z線結構較清晰，線粒體略有增生，嵴較清晰，心肌細胞間可見膠原纖維輕度增生；26月齡大鼠心肌細胞腫脹，肌原纖維結構松散，部分肌原纖維斷裂、溶解，排列紊亂，部分Z線消失，線粒體嵴減少，結構不清晰，心肌細胞間可見大量膠原纖維。見圖3。

圖3 不同月齡大鼠左室心肌組織超微結構(× 1 500)

2.5各組大鼠心肌組織和血清中TNF-α含量 6月齡大鼠心肌組織和血清中TNF-α表達最少，18月齡大鼠心肌組織和血清中TNF-α含量與6月齡大鼠組比較明顯增加(P<0.05)，26月齡大鼠與18月齡及6月齡大鼠相比，心肌組織中和血清中TNF-α水平均有顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表3。

圖4 各組大鼠左室心肌組織中TNF-α的表達(DAB，×200)

表3 不同月齡大鼠心肌組織和血清TNF-α含量比較

2.6各組大鼠心功能參數及心肌組織和血清中TNF-α含量的相關性 各組大鼠心功能參數IVSD、LVESD、LVEDD、E/E′和CVF%與心肌組織及血清中TNF-α顯著正相關(P<0.05)，LVEF、LVFS、E/A與TNF-α水平顯著負相關(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠心功能參數與TNF-α的相關性

3 討 論

超聲心動圖與心臟磁共振(CMR)、心臟核素顯像等技術相比具有無創、簡便、重復性好等優勢，在臨床上被廣泛用于心臟形態、結構和功能的評價。M型心臟超聲、二尖瓣血流頻譜和組織多普勒在心臟評估中最為常用〔10,11〕。年齡是影響心臟結構和功能的重要因素。本實驗結果表明，隨著大鼠月齡的增加，心臟結構和功能逐漸變差。

同時，本研究還從病理學檢測考察了增齡性對心臟病理改變的影響。有研究表明，患者在早期心臟舒張功能有輕度減退，中期心肌細胞凋亡或死亡,心臟舒張功能異常或輕度收縮功能異常，晚期則會有微血管病變,心臟舒張功能、收縮功能異常〔12〕。隨著大鼠月齡的增加，本研究脈沖多普勒發現心臟減速時間延長,提示心臟舒張功能減退。此時，心臟心肌組織伴隨明顯的病理改變，最顯著的就是心肌纖維化。本研究結果說明，增齡性帶來的心臟病理改變是隨著月齡的增加，心肌間質會有大量膠原纖維沉積，尤其是老年化大鼠最為顯著。膠原纖維在心肌細胞間質大量沉積進而導致心肌順應性下降,舒張功能減退。增齡性伴隨的心肌細胞攣縮、肌原纖維收縮帶形成,細胞水腫,線粒體變性外逸,融合、漂浮,結構不清,心肌細胞內多處出現脂褐素等老化現象，提示心肌退行性變加重，因而心臟結構異常，功能減退。

研究表明〔13～15〕，促炎細胞因子TNF-α、IL-6等均能直接影響心肌收縮功能，并導致心衰。本研究提示隨著SD大鼠的老年化，心臟組織中存在過度的炎癥反應及免疫功能紊亂，最終可能引發心肌纖維化，心力衰竭，從而導致死亡。

綜上所述，SD大鼠隨著老年化會出現心臟結構異常和心臟功能減退的現象，同時伴隨明顯的心肌細胞的病理改變。老齡性心臟結構及功能的異常與炎癥因子的表達水平存在相關性。