急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細胞及其遷移潛能

白雪峰 何信眾

(桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，浙江 桐鄉(xiāng) 314500)

人類上呼吸道反復暴露于多種吸入的微生物，因此，上呼吸道感染是初級衛(wèi)生保健急診室就診的最常見原因〔1,2〕。上呼吸道病原體中高感染率，流感流行和抗生素耐藥性增加，都表明需要更有效的疫苗接種策略來保護這一門戶〔3〕。黏膜抗體在上呼吸道的黏膜防御中發(fā)揮關鍵作用，因為其是干擾感染的初始步驟，可防止病原體的附著〔4～6〕。特異性抗體分泌細胞(ASCs)的傳播具有組織選擇性，其中歸巢受體(HR)和趨化因子受體起中心作用〔7，8〕。尚不完全了解哪些HR將細胞引導至呼吸道，并且在該位點引起的反應的靶向仍未在人類中進行充分研究。因此本文對急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細胞及其遷移潛能進行研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月至2018年12月的260例門診患者，其中急性扁桃體炎130例(扁桃體炎組)，急性鼻竇炎130例(鼻竇炎組)。急性扁桃體炎診斷〔9〕基于典型病史，包括發(fā)燒，喉嚨痛，前頸椎病等。急性鼻竇炎診斷典型病史包括鼻充血，膿性鼻涕，面部疼痛或壓力，嗅覺受損等，并且上頜灌溉細菌膿性分泌物≥105cfu/ml，患者細菌培養(yǎng)陽性，且癥狀持續(xù)時間少于2 w。選取90例在醫(yī)院體檢的健康志愿者為健康組。3組一般情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。排除標準〔10〕：①肝功能或腎功能異常；②嚴重高血壓；③器質性心臟病；④糖尿病；⑤惡性腫瘤；⑥免疫功能低下；⑦先天性疾病。患者均獲得書面知情同意書，研究方案和數(shù)據(jù)管理得到地區(qū)衛(wèi)生服務人類研究倫理委員會的批準。

表1 3組一般情況比較

1.2實驗設計 第1次就診期間，由耳科醫(yī)生進行上頜灌洗(鼻竇炎組)并采集咽拭子(扁桃體炎組)，根據(jù)主治醫(yī)院的微生物實驗室的程序分離病原體。將每種分離物懸浮在0.9%鹽水溶液中，加入濃度為2%的甲醛，將濃度調節(jié)至108細菌/ml磷酸鹽緩沖液(PBS)。在急性鼻竇炎或扁桃體炎患者中尋找病原體特異性循環(huán)ASCs。使用酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)測定法分析病原體特異性ASCs及其同種型分布，并通過免疫磁性細胞分選和ELISPOT組合檢測整合素α4β7和L-選擇素的表達。

1.3觀察指標 進行總外周血單個核細胞(PBMC)群體、受體陽性和陰性亞群中病原體特異性ASC分析和IgA，IgG和IgM的ELISPOT分析。為評估病原體特異性ASC，致病菌株的懸浮液使用96孔微量滴定板。在IgA、IgG和IgM的ELISPOT分析中使用人IgA，IgM或IgG特異性抗血清(在PBS中稀釋)。洗滌并掩蔽孔后，加入總PBMC群的等分試樣或受體陽性和陰性亞群。用堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗人IgA，IgG或IgM檢測細胞分泌的抗體/免疫球蛋白，接著用熔化的瓊脂糖中的底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯)檢測。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 通過HE法觀察急病原體特異性漿細胞。將樣本置于包埋盒中沖洗30 min后用一定濃度梯度的酒精進行脫水處理，然后用石蠟包埋，切成5 μm厚度大小，烘干后進行HE染色。使用明視場顯微鏡和掃描共聚焦激光顯微鏡檢查所有樣品并拍照。

1.5細胞活力測定 在96孔板中培養(yǎng)病原體特異性漿細胞，以1/10稀釋度向每個孔中加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標儀在450 nm處測量吸光度。根據(jù)的平均光密度(OD)計算細胞活力的百分比：細胞活力的百分比= OD處理組/OD對照組×100%。實驗重復3次。

1.6遷移相關蛋白免疫印跡分析 靜脈抽取血液樣本，離心稀釋，將離心樣本放置于100 μl緩沖液中，通過BCA蛋白質測定試劑盒測定全細胞提取物的含量。加入10 μg樣品并在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離。轉移后硝酸纖維素膜在4℃下用5%牛血清白蛋白封閉過夜處理，用指示的抗體探測。使用適當?shù)拿庖咔虻鞍自噭┩ㄟ^增強化學發(fā)光觀察印跡。

1.7整合素α4β7、皮膚相關抗原(CLA)及L-選擇素檢測方法 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集外周血2 ml，搖勻后置入4℃冰箱內保存，24 h內用流式細胞儀檢測整合素α4β7、L-選擇素和CLA。采用直接法檢測整合素α4β7及L-選擇素。整合素α4β7異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠多克隆抗體和L-選擇素標記的鼠抗人單克隆抗體分別購自Santa Cruz Biotechnology 公司、eBioscience公司。流式細胞儀(美國庫爾特公司EPITS′ XL)設定激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為526 nm，利用EPITS′ XL配套軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1鼻竇炎組和扁桃體炎組病原體分析 鼻竇炎組病原體主要為肺炎桿菌〔60例(46.15%)〕和流感病毒〔60例(46.15%)〕，10例為咽峽炎鏈球菌感染。扁桃體炎組病原體主要為化膿性鏈球菌〔110例(84.62%)〕，20例為β-溶血性鏈球菌感染。鼻竇炎感染有70例(53.85%)體溫超過38℃，扁桃體炎組有90例(69.23%)體溫超過38℃。

2.2病原體特異性漿細胞染色 與健康組相比，鼻竇炎組和扁桃體炎組中病原體特異性漿細胞含量較高，染色顏色也較深，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 病原體特異性漿細胞染色(×100)

2.3細胞活力檢測 與健康組相比，鼻竇炎組和扁桃體炎組中細胞活力顯著較高(P<0.05)。見表2。

表2 細胞數(shù)目、染色強度及CCK-8檢測細胞活力

與健康組比較：1)P<0.05；下表同

2.4遷移相關蛋白免疫印跡分析 鼻竇炎組和扁桃體炎組與健康組相比基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表達均明顯增加(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 遷移相關蛋白免疫印跡

表3 遷移相關蛋白的表達量

2.5整合素α4β7、L-選擇素和CLA 與健康組相比，鼻竇炎組和扁桃體炎組整合素α4β7、L-選擇素和CLA表達均明顯增加(P<0.05)。見表4。

表4 整合素α4β7，L-選擇素和CLA在病原體特異性ASCs上表達

3 討 論

IgG證實是鼻竇炎和扁桃體炎中最常見的Ig同種型。符合以前對于上呼吸道疫苗接種的研究：扁桃體霍亂免疫和鼻內流感疫苗接種已被證明在循環(huán)和扁桃體和腺樣體中誘導IgG主導的漿母細胞反應〔11〕。IgG同種型在肺炎的漿細胞反應中也占主導地位。據(jù)報道，在腺樣體中存在具有豐富的聚合IgA，J鏈和多聚免疫球蛋白受體(pIgR)/SC特異性上皮成分的黏膜分泌系統(tǒng)，但在扁桃體中沒有〔12,13〕。因此，鼻竇炎患者的IgA-ASC反應頻率高于扁桃體炎可能反映了該疾病中腺樣體中更明顯的B細胞引發(fā)〔14,15〕。

在急性鼻竇炎和扁桃體炎研究中，病原體特異性漿母細胞的整體歸巢概況相似：大多數(shù)細胞表達L-選擇素，并且小于四分之一整合素α4β7或CLA。這種相似性表明參與相同的激活位點。數(shù)據(jù)揭示了在上呼吸道引發(fā)的漿母細胞的獨特歸巢特征：該特征不僅與腹瀉(整合素α4β7高，L-選擇素低，CLA可忽略不計)或上尿路感染(α4β7中/高，L-選擇素中/高和CLA低)特征相似，也用于下呼吸道感染(整合素α4β7中，L-選擇素高，CLA低)〔16,17〕。該特征似乎與通過腸胃外疫苗接種引起的全身性免疫應答類型(整合素α4β7低，L-選擇素高，CLA 低)最相似〔18〕。

據(jù)報道，高水平的MMP-2和MMP-9可增加內皮細胞的遷移〔3，19〕。在本研究中，MMP-2和MMP-9表達升高，從而影響急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細胞的遷移能力。從中可知，急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細胞表達較高，細胞活力增加，遷移相關蛋白表達較高。證明急性細菌性上呼吸道感染在循環(huán)中誘導病原體特異性漿母細胞，IgG漿母細胞是主要的同種型。對于上呼吸道，顯示出具有高比例的L-選擇素和不足的整合素α4β7和CLA的特征性歸巢譜。

綜上所述，急性鼻竇炎和扁桃體炎中病原體特異性漿細胞表達較高，細胞活力增加，遷移相關蛋白表達較高。