基于網絡藥理學探討六合丹治療急性胰腺炎的物質基礎和分子機制

王銳 韓晨霞 彭楊 王怡欽 夏慶 杜丹

1四川大學華西醫院中西醫結合科，成都 610041；2四川大學華西醫院華西-華盛頓線粒體與代謝研究中心，成都 610041

中醫藥對AP的臨床治療作用在國內已經獲得廣泛認可。四川大學華西醫院中西醫結合科自上世紀90年代確立了“益活清下”法，使用內服、外敷或灌腸等給藥途徑治療AP，明顯改善了AP患者的胃腸動力，減緩病情發展并縮短住院病程[1-2]。六合丹作為傳統外敷劑具有清熱解毒、消腫止痛和散結化瘀等功效[3-4]。采用六合丹外敷可以快速減輕AP患者腹部和腰肋部腫脹疼痛、促進積液吸收、減少后期囊腫等并發癥發生以及縮短患者再進食時間[2,5-7]。目前對于六合丹治療AP的研究[7-10]多從臨床表征、入血成分或單一靶點為切入點展開，無法系統地闡釋六合丹有效成分及作用機制。隨著網絡藥理學的提出，多成分、多靶點及系統調控的研究思路有利于推進中醫藥的深入研究及臨床應用[11-13]。本研究采用網絡藥理學的方法闡述六合丹治療AP的活性化學成分、靶點及相關通路。

資料與方法

一、六合丹活性化學成分及靶點

通過中醫百科全書數據庫(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM)[14]檢索六合丹的6味中藥材(大黃、黃柏、白芷、白術、薄荷和烏梅)，獲得六合丹所有的化學成分，并通過數據庫靶點預測功能，獲得六合丹的活性化學成分，根據化合物結構相似度評分Tanimoto>0.8，預測相關靶點。利用UniProt數據庫對獲得的靶點進行檢索，物種限定為“Homo sapiens”，得到官方名稱。

二、AP相關靶點篩選

通過在人類疾病信息相關數據庫[OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、DisGeNET、HPO(The Human Phenotype Ontology)、NCBI(National Center for Biotechnology Information)]中以“acute pancreatitis”作為檢索詞對AP相關基因進行檢索、篩查并整合，獲得AP相關的候選靶點。利用UniProt數據庫對候選靶點進行檢索，物種限定為“Homo sapiens”，得到官方名稱。

三、六合丹治療AP的活性化學成分及靶點

將六合丹化學成分對應的靶點與AP的候選靶點取交集，重合靶點即為六合丹活性成分作用于AP的靶點，同時可以得到每個靶點對應的活性化學成分。

四、靶點蛋白相互作用網絡構建及關鍵靶點篩選

利用STRING(Search Tool for Retrieval of Interacting Proteias)數據庫[15]對靶點蛋白與蛋白之間的相互作用關系進行分析。將靶點信息導入SRTING數據庫，物種限定為“Homo sapiens”，每對蛋白之間相互作用可信度設置為>0.7，將以上限定作為篩選條件得到靶點的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)網絡。將PPI網絡信息導入Cytoscape 3.6.0軟件，利用網絡分析功能分析網絡的拓撲屬性，并根據節點度值、中介中心性兩個網絡拓撲參數篩選PPI的核心靶點。

五、功能富集分析

將六合丹治療AP的作用靶點上傳至CPDB網站[16]及STRING網站，物種限定為“Homo sapiens”，分別進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。以P<0.01、錯誤發現率(false discovery rate,FDR)<0.05為篩選標準，得到靶點富集的GO和KEGG通路信息。

六、構建六合丹治療AP的“中藥材-活性化學成分-靶點-通路”網絡圖

將上述中藥材、對應活性化學成分、作用靶點及通路信息導入Cytoscape軟件進行網絡構建，分別用不同顏色及形狀的節點(node)表示中藥材、活性化合物、靶點及通路，并用“邊”來連接中藥材、活性化學成分、靶點及其對應通路。同時利用網絡分析功能分析網絡的拓撲屬性，并根據節點度值、中介中心性兩個網絡拓撲參數篩選六合丹治療AP的網絡中重要活性化學成分及靶點。

結 果

一、六合丹化合物及靶點數據庫

六合丹6味藥材共找到213種化合物， 其中大黃88種、黃柏24種、白術21種、白芷54種、薄荷27種及烏梅4種化合物。將六合丹中含有靶點(Tanimoto評分>0.8)的化合物定義為活性化學成分，顯示大黃、黃柏、白術、白芷、薄荷、烏梅分別含有76、12、12、19、7、3種活性化學成分，分別對應147、113、114、279、48、62個相應靶點。刪除重復值后，共獲得128種活性化學成分，對應505個靶點。

二、AP相關靶點

通過OMIM、DisGeNet、HPO和NCBI數據庫檢索，分別獲得AP相關靶點10、268、52和294個。刪除重復值后，共獲得530個靶點。

三、六合丹治療AP的活性化學成分和靶點

通過分析整合六合丹的128種活性化學成分、對應的505個靶點和530個AP相關靶點，最終得到六合丹治療AP的活性化學成分共111種(表1、2)，作用靶點共39個(表3)。大黃、黃柏、白術、白芷、薄荷、烏梅分別含有72、11、9、13、4和3種活性化學成分，分別可調控19、7、6、25、5和5個AP靶點。

表1 大黃治療急性胰腺炎的活性化學成分

表2 黃柏、白術、白芷、薄荷、烏梅治療急性胰腺炎的活性化學成分

表3 六合丹治療急性胰腺炎活性成分的靶點

四、39個靶點的PPI網絡構建及關鍵靶點篩選

通過STRING數據庫構建了六合丹治療AP的39個作用靶點的PPI網絡，發現其中26個靶點具有相互作用關系(圖1)。根據節點度值、中介中心性兩個網絡拓撲參數顯示，INS、FABP1、TLR4、PTGS2和CYP2E1是PPI網絡的核心靶點。

圖1 六合丹治療急性胰腺炎的PPI網絡

五、39個靶點的富集功能分析

對39個共同靶點進行GO功能分析，根據P<0.01共獲得650條富集信息，其中生物學過程575條，分子功能49條，細胞組成26條。生物學過程前20條，細胞組成和分子功能的前10條富集信息見圖2。

對39個共同靶點行KEGG通路富集分析，獲得46條信息。根據FDR校正后的P值排序，前10位的KEGG通路見表4，涉及到與AP發生發展過程密切相關的胰腺分泌、膽汁分泌、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptors, PPAR)信號通路、脂肪的消化吸收、花生四烯酸代謝及鈣信號通路等。

圖2 六合丹治療急性胰腺炎靶點的GO功能富集圖

表4 六合丹治療急性胰腺炎的靶點KEGG通路富集分析

注：KEGG為京都基因與基因組百科全書；PPAR為過氧化物酶體增殖物激活受體

六、六合丹治療AP的“中藥材-活性化學成分-靶點-通路”網絡圖

根據以上結果，通過Cytoscape軟件繪制六合丹治療AP的網絡圖，根據節點度值調節節點大小，重點突出關鍵靶點及主要活性化合物(圖3)。網絡圖中共包括166個節點和480條邊。節點度值和中介中心度兩個網絡拓撲參數顯示，procyanidin b2 3,3′-di-O-gallate、procyanidin b1 3′O-gallate、kaempferol、tridecanoic acid、cetylic acid和13-methyl pentadecanoic acid 等活性化合物及ALDH2、ALB、ABCB1、CYP1A1和PTGS2等作用靶點在六合丹治療AP的網絡中具有重要作用。

注：紅色方塊表示中藥材，綠色菱形表示對應的111種活性化學成分，藍色v型圖標表示39個靶點；粉色三角形表示KEGG富集排名前10的通路；“邊”表示中藥材、活性化合物、靶點及通路之間的關系

圖3 六合丹治療急性胰腺炎的“中藥材-活性化學成分-靶點-通路”網絡圖

討 論

AP屬于中醫“腹痛”、“脾心痛”、“胰癉”范疇，病機主要是肝脾氣機郁滯導致濕、熱、瘀蘊結中焦；中醫治療原則主要以疏肝理脾、清熱利濕、恢復胃腸通降之特性[17-18]。近年應用中藥復方治療AP的療效得到肯定，中藥的治療作用具有多環節多靶點的效應，可以調節胃腸動力、腸道屏障功能、細胞因子和炎癥遞質、微循環、胰酶活性等多個方面[10,19-27]。六合丹作為傳統中藥外敷治療AP已有20余年，臨床療效顯著。實驗也證明六合丹外敷可以改善AP大鼠微循環障礙、減輕氧化應激和炎癥反應、降低血淀粉酶水平[8-10,28]。本研究采用網絡藥理學的方法，第一次構建了六合丹治療AP的“中藥材-活性化學成分-靶點-通路”網絡，系統性地闡釋了六合丹治療AP的物質基礎和分子機制。本結果顯示，六合丹治療AP的活性化學成分有111種，包括蒽醌、黃酮、香豆素、生物堿和脂肪酸等幾類化學成分；可以通過39個治療靶點(ALDH2、ALB、ABCB1、CYP1A1和PTGS2等)影響藥物代謝、炎癥調節和氧化還原等多個生物學過程以及胰腺分泌、膽汁分泌和PPAR信號通路等多條通路，達到治療AP的效果。

本研究發現，六合丹中大部分活性化學成分作用于2個及以上靶點，其中大黃所含活性成分最多，與本課題組前期對大承氣湯的研究結果類似[29]，其所含蒽醌類化學成分具有抗菌、抗炎、瀉下、調節細胞周期和凋亡等藥理作用[30-33]。此外其他幾味中藥所含化學成分也具有多種藥理活性：黃柏中β-sitosterol具有良好的抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等活性[34]；白術中atractylenolide Ⅲ具有保護胃腸功能、抗炎、抗腫瘤等作用[35-38]；烏梅中的naringenin屬于黃酮類，具有雌激素樣作用、調節能量代謝、抗炎、抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等效果[39]。本研究結果顯示，與活性成分關聯較多的靶點有ABCB1、ALB、CYP1A1、 ALDH2和PTGS2，可見單個成分可以作用于多個靶點，且一個靶點也可以同時與多個成分相關聯，說明六合丹治療AP具有多成分和多靶點的特性。

通過對靶點PPI網絡分析發現，INS、FABP1、TLR4、PTGS2和CYP2E1為LHD治療AP的主要作用靶點。AP患者由于胰腺組織受損而內外分泌功能紊亂，影響胰島素的分泌與排泄，易引起血糖升高，而血糖水平與患者病情嚴重程度有關[40-41]；AP發病時的嚴重炎癥反應及微血管滲漏會引起腸道缺血、缺氧造成黏膜上皮損傷[42]；FABP1和脂質的轉運與代謝調節及器官組織損傷有關，血清FABP1水平在AP患者中明顯升高，且與患者病情程度、預后以及并發癥的發展有關[43-44]；TLR4是Toll樣受體家族的成員之一，可以通過活化NF-κB引起多種促炎細胞因子的激活，引起炎癥級聯反應，最終導致全身炎癥反應綜合征[45]，動物實驗研究也表明胰腺組織中存在TLR4表達，抑制或者下調TLR4能夠治療AP[46-48]。PLGS2也稱為環氧化酶2，通常的炎癥微環境會誘導其表達，是花生四烯酸代謝的關鍵酶[49]。

GO富集分析顯示39個靶點分布于胞外區、細胞外間隙、細胞質、細胞膜和細胞核中，參與藥物反應、細胞內外刺激、炎癥調節、膽汁酸受體活性和氧化還原酶活性等生物學過程。KEGG通路富集涉及的胰腺分泌、膽汁分泌、PPAR信號通路、 脂肪的消化吸收、花生四烯酸代謝及鈣信號通路等均與AP息息相關。AP模型早期事件之一就是胰酶持續合成，但胰管阻塞導致分泌受阻，胰酶被活化，并激活其他消化酶，導致胰腺組織自身消化性損傷[50-52]；膽總管遠端阻塞導致膽汁逆流到胰管可激活胰腺酶原，膽汁酸以及不飽和脂肪酸均可引起腺泡細胞內異常Ca2+信號，導致酶原激活、線粒損傷和細胞壞死[53-55]；花生四烯酸代謝網絡是產生炎癥遞質的主要網絡，其代謝產物(前列腺素類、血小板活化因子和白三烯)會促進中性粒細胞聚集和黏附，同時也提高血管通透性，進而導致血栓出現并引起出血現象[9,18,55]。

綜上所述，本研究初步明確了六合丹是通過多成分、多靶點和多途通路發揮治療AP的作用機制的，為進一步研究六合丹的藥理機制提供了初步探討與預測，確切的作用機制仍需后續實驗研究驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突