高效液相色譜測定蔬菜中吡蟲啉方法優化

王先桂，曾 丹，蒙煥妮

(1.茅臺學院，貴州 仁懷 564501； 2.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州 遵義 563000； 3.關嶺布依族苗族自治縣農業農村局，貴州 關嶺 561300)

吡蟲啉屬于新煙堿類殺蟲劑，該類藥物具有殺蟲譜廣、用量低、內吸傳導性好、作用機制新穎和環境相容性高等特點，被廣泛用于水果蔬菜種植過程中[1]，可高效殺滅對有機磷農藥等傳統殺蟲劑有抗藥性的害蟲，該藥持久期長，對人類和哺乳動物會產生慢性毒理效應和一定的神經毒性[2]，0.05 mg/kg的吡蟲啉就會損害人體淋巴細胞的遺傳物質DNA[3-5]，在20℃條件下吡蟲啉在水中溶解度達0.61 g/L[6]。近年來，隨著吡蟲啉在農業生產上使用量逐漸增加，其在農產品上的殘留量越來越受到關注。

吡蟲啉是極性化合物，具有熱不穩定性的特點，適用于使用液相色譜系統進行分析檢測，液相色譜-質譜聯用技術是檢測吡蟲啉的有效技術，但液相色譜-質譜聯用設備昂貴，普及難度較大，結合縣級農檢機構的設備配置現狀，一般選用高效液相色譜儀進行檢測[7-9]。目前在實際工作中，按照現行有效的國家標準GB/T 23379-2009對蔬菜中吡蟲啉進行測定時發現按照標準操作得到的回收率較低，通過對操作過程的優化后可得到較好的回收率。因此，筆者就改良優化后的操作技術介紹如下，以供吡蟲啉檢測者參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 白菜樣品于菜市場上隨機購買。

1.1.2 試劑 農藥標準品吡蟲啉(純度≥99.0%)來自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，固相萃取柱(C18,200 mg，3 mL)來自博納艾杰爾科技公司，乙腈(色譜純)來自上海安譜實驗科技股份有限公司，氯化鈉、磷酸均為分析純，有機濾膜(孔徑0.45 μm)來自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀為美國Agilent HPLC 1260-VWD；液相色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；食品攪拌機為博朗(Braun)FP3010；勻漿機為德國IKA T10 高速組織勻漿機；分析天平ME204E購自瑞士METTLER TOLEDO；離心機3K15購自德國SIGMA；旋轉蒸發儀RE-52AA購自北京科偉永興儀器有限公司；循環水式真空泵SHB-Ⅲ，北京科偉永興儀器有限公司；超聲波清洗機SB-800DT，寧波新芝生物科技股份有限公司；超純水機WP-UP-WF-20購自四川沃特爾處理設備有限公司。

1.3 吡蟲啉標準溶液的配制

1.3.1 吡蟲啉標準儲備液 稱取10 mg左右(精確到0.10 mg)吡蟲啉標準品置于10 mL的容量瓶中，加乙腈溶解定容，如果溶解不徹底可超聲溶解，配制成1 000 μg/mL左右吡蟲啉標準儲備液，-18℃冰箱避光保存。

1.3.2 吡蟲啉標準工作液 根據檢測工作的需要配制成不同濃度的標準工作液，4℃避光保存。

1.4 蔬菜樣品的制備

將市場上隨機購買的白菜樣品切碎，用食品攪拌機打碎均勻，備用；稱取10 g白菜樣品于100 mL離心管中，添加吡蟲啉標準液用于添加回收試驗，同時也準備空白樣品。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取 樣品分別加入20 mL乙腈，用高速勻漿機勻漿提取1 min，加入5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，將離心管放入離心機，在4 000 r/min轉速下離心5 min，取上清液10 mL移入50 mL梨形瓶中，38℃旋轉蒸發至近干狀態，加入5%乙腈2 mL至梨形瓶中，超聲溶解并混勻梨形瓶內溶液，待凈化。

1.5.2 凈化 將固相萃取柱放置在固相萃取裝置或柱架上，加樣前用5 mL 5%乙腈平衡柱子，待液面即將到達固相萃取柱填料上方時，從上述梨形瓶中移取1 mL旋蒸后溶解的溶液至固相萃取柱上，控制3 s/滴左右的速度使溶液流經萃取柱，待無液滴滴下時用5 mL水洗柱，棄去并抽干柱子，最后用1 mL 40%乙腈緩慢洗脫并擠干柱子，收集洗脫液，用0.45 μm的有機濾膜過濾洗脫液，待測。

1.6 色譜條件

采用液相色譜柱等度洗脫方式，流動相A為0.1%磷酸水溶液，流動相B為乙腈，流動相比例A∶B=75∶25，無后運行時間。柱溫30℃，進樣量20 μL，檢測波長270 nm。

1.7 標準曲線的繪制

將吡蟲啉標準工作液用30%乙腈稀釋成質量濃度分別為5.00 μg/mL、2.50 μg/mL、1.00 μg/mL、0.50 μg/mL、0.25 μg/mL、0.10 μg/mL的標準溶液，與空白樣品和添加回收試驗樣品共建序列進樣。用脫機軟件分析，以色譜峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.8 回收率與精密度試驗

在白菜樣品中添加0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg 3個水平的吡蟲啉，按照優化后的方法進行樣品前處理，每個水平重復6次，計算回收率和相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 線性范圍

經檢測,標準曲線在0.10～5.00 μg/mL內，吡蟲啉在液相色譜中的響應值與質量濃度呈正相關，線性方程為y=49.102 1x-1.873 5，R=0.999 8。

2.2 色譜條件的選擇

通過可變波長掃描檢測器掃描波長最終確定吡蟲啉的最大吸收波長值為270 nm，因此選取270 nm的波長用于吡蟲啉的檢測。經過分離洗脫，吡蟲啉峰形對稱，無拖尾現象，確定為吡蟲啉檢測的色譜條件。以此條件進行吡蟲啉標準溶液(圖1)、白菜樣品中加吡蟲啉(圖2)、白菜樣品空白(圖3)色譜圖的繪制。

2.3 前處理優化

將提取步驟中旋轉蒸發至近干后加入到梨形瓶中的溶液由25%乙腈優化為5%乙腈，將凈化步驟中用于平衡萃取柱的溶液由25%乙腈優化為5%乙腈，將洗脫液由乙腈優化為40%乙腈，由此得到優化前后吡蟲啉回收率平均值由48.6%提至95.8%，相對標準偏差由4.3%降至3.8%。說明優化后回收率遠高于優化前的回收率，且優化后的回收率達到了檢測的準確度要求，說明前處理步驟優化效果良好。

2.5 回收率與精密度

經計算,樣品中添加0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg 3個水平的吡蟲啉，吡蟲啉的回收率為89.2%～101.9%，相對標準偏差(RSD)為2.9%～4.5%，符合農藥殘留分析對回收率的要求。表明，前處理優化后吡蟲啉的回收率更高，且重復性更好。

2.6 檢測限與定量限

根據利用信噪比的倍數與檢測限和定量限之間的關系得到優化后的吡蟲啉LOD為0.003 mg/kg，LOQ為0.010 mg/kg。

3 結論

將前處理步驟中25%乙腈優化為5%乙腈，避免了固相萃取柱的“穿漏”現象。由于乙腈是強極性的有機溶液，用乙腈或乙腈與水的混合液對萃取柱上的吡蟲啉進行洗脫，當選用25%乙腈作為旋蒸瓶溶解液和萃取柱的平衡液時，其溶液極性偏大，導致殘留在柱上的平衡液和上樣液的乙腈比例偏大，在過柱時易將吡蟲啉從柱上帶下來，這就是萃取柱的“穿漏”現象。當降低為5%乙腈時，其極性無法將吡蟲啉從萃取柱上帶下來，使得吡蟲啉留在了柱床上，選用40%乙腈作為洗脫液，其極性可以順利的將萃取柱上的吡蟲啉洗脫下來，從而吡蟲啉的回收率達到檢測要求。洗脫液40%乙腈的比例也更接近于流動相的比例，使得樣液進入液相色譜系統后與流動相更加契合，峰形等效果基本不受影響。試驗優化了前處理步驟中互溶液、平衡液和洗脫液的乙腈比例，確立了吡蟲啉的高效液相色譜檢測方法。優化后的方法所用儀器設備無變化，儀器無后運行時間，方法學驗證結果準確穩定可靠。該方法在各類型蔬菜和水果中均可應用。