不同配比復合益生菌對灰海馬幼苗存活、生長及免疫的影響

蔡怡山，張 東，劉 鑫，林聽聽，夏連軍

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090）

灰海馬（Hippocampus erectus），又稱線紋海馬，我國于2009年從美洲引進［1］，因其個體大、生長快、養殖密度高等優點，已成為我國目前海馬養殖的主要品種。經過近10年的養殖探索，灰海馬的人工繁育和養殖技術獲得了很大的突破［2-6］。近年來，我國沿海地區從南到北（如海南、廣東、福建、山東、河北等）不斷有灰海馬規?；B殖成功的報道。盡管灰海馬規?；B殖取得了可喜的成效，但和其他養殖海馬一樣［7］，灰海馬易患腸炎病，因而限制了灰海馬養殖產業的發展。

海馬主要使用價值在于藥用，為防止藥用成分受到污染或者藥用價值降低，用傳統抗菌藥物治療海馬腸炎病害并不適合，而且生產實踐也表明使用抗菌藥物的治療效果并不理想。在患病灰海馬和健康灰海馬腸道菌群的研究中發現，健康個體和患病個體腸道內均含有大量的弧菌屬（Vibrio）細菌，但是健康個體還含有大量的乳桿菌屬（Lactobacillus）細菌，而患病個體極度缺乏乳桿菌屬細菌［8］。在庫達海馬（H.kuda）中也發現健康個體和患病個體腸道內均含大量的弧菌屬細菌，但健康個體較患病個體含顯著豐富的芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌［9］。這兩項研究報道突顯了益生菌在維持海馬健康方面的作用。此外，借鑒益生菌在養殖魚類過程中發揮作用的成功案例［10-11］，推測益生菌可能對海馬腸炎具有預防甚至治療作用。

目前水產養殖中最常見的益生菌有芽孢桿菌和乳酸菌（lactic acid bacteria）。其中，芽孢桿菌中最常用的有枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［12］和凝結芽孢桿菌（B.coagulans）［13］。乳酸菌種類繁多，按形狀可分桿菌和球菌，桿菌又分乳桿菌屬和雙岐桿菌屬（Bifidobacterium），球菌又分鏈球菌屬（Streptococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）。在水產養殖中最常用的乳酸菌有植物乳桿菌（L.plantarum）［14］、嗜酸乳酸菌（L.acidophilus）［15］和糞腸球菌（E.faecalis）［16-17］。這些益生菌在水產養殖中均取得了良好的效果。此外，已有不少研究表明，與單種益生菌相比，復合益生菌不僅集合了單種益生菌的功能，而且增加了協同共生作用，更適合復雜多變的生態環境［18］。SALINAS等［19-20］、ALY等［21］和夏磊等［22］分別研究發現，兩種或者3種益生菌聯合添加對各自養殖動物（金頭鯛Sparus aurata、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus、凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei）的益生效果要明顯優于單種菌。然而，復合菌以何種配比添加才能達到最優效果，國內外研究較少，這也制約了復合益生菌的應用。另外，復合菌使用效果也因種而異［20-22］。為更好地研究益生菌對海馬養殖的有益效果，本研究以枯草芽孢桿菌以及乳酸菌中的植物乳桿菌和糞腸球菌為復合益生菌源，測試單菌及不同配比的復合益生菌對灰海馬幼苗養殖效果的影響，以期篩選出效果最佳的復合菌配比。

1 材料與方法

1.1 實驗菌粉

枯草芽孢桿菌購自南京漁豐生物科技有限公司，植物乳桿菌和糞腸球菌購自中國臺灣亞芯生物科技有限公司。三者均為白色或類白色粉末，使用前按產品說明書的方法活化后，分別用乳酸菌常用培養基（MRS）和芽孢桿菌常用培養基檢測活菌量，得出活菌量均≥1×1011cfu·g-1。

1.2 實驗配比

本實驗所設定的3種益生菌的配比及分組見表1。根據產品說明書的參考使用量，本實驗每組的菌粉添加濃度為15 mg·L-1，即往400 L的水體中加入總菌粉6 g。

表1 實驗處理設計Tab.1 Experim ental design

1.3 實驗動物及方法

實驗灰海馬2018年7—10月取自福建紳藍生物科技有限公司儲備的灰海馬優質親本同一天所產的新生苗［初始體高（1.0±0.1）cm］。本實驗共分10組（表1），每組3個重復，每個重復在1個裝有400 L自然海水（水溫28～29℃、鹽度31～32）、持續充氣的玻璃缸養殖桶進行。

實驗開始時，將新生苗隨機分配到各個養殖桶中，每桶200尾。將菌粉制備成懸濁液后，按所設定的配比向養殖桶中添加菌粉，即每桶6 g（濃度為15 mg·L-1）。之后每隔兩天添菌一次。添菌前，先將養殖桶中的水排去2／3，然后補加新鮮海水至400 L。整個實驗期間，除添菌當天換水外，其他時間均不換水；幼苗每天投喂足量橈足類，上午和下午各一次。實驗共持續50 d。

1.4 指標測定

1.4.1 養殖水體菌群

實驗結束后，采集各組的養殖水樣，分析水體中的弧菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌和乳酸菌。用硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBS）培養基檢測弧菌總數，用 Man Rogosa Sharpe（MRS）培養基檢測乳酸菌總數，用芽孢桿菌常用培養基 （葡萄糖 10.0 g· L-1、磷酸鈣 5.0 g·L-1、硫酸銨 0.5 g·L-1、氯化鉀 0.2 g·L-1、七水硫酸鎂 0.1 g·L-1、硫酸錳 0.000 1 g·L-1、硫酸亞鐵 0.000 1 g·L-1、酵母提取物 0.5 g·L-1、瓊脂 20.0 g·L-1，pH 7.0±0.2）檢測芽孢桿菌總數。將水樣用滅菌生理鹽水梯度稀釋，取1×10-1、1×10-2、1×10-33個稀釋度，每個稀釋度100μL涂布于細菌培養基平板上，于恒溫培養箱中培養，其中弧菌和芽孢桿菌28℃培養24 h，乳酸菌37℃培養48 h。培養結束后，計數各培養基平板上的菌落數，數值以每毫升水含菌落數的對數（lg N）表示。

1.4.2 存活和生長

實驗結束后，清點各個養殖桶存活的幼苗數量，計算存活率。之后，每個養殖桶隨機取幼苗20尾，測量體長，用于計算特定生長率（SGR）。

SGR＝100×（lnLt-lnL0）／T（1）

式（1）中，Lt和L0分別表示實驗結束后和開始前各組海馬的平均體長，T表示實驗時間。

1.4.3 腸道免疫及菌群

體長測量結束后，每個養殖桶隨機取幼苗12尾，無菌解剖取其腸道。每4尾幼苗腸道置于1個DNAse／RNAse-Free凍存管，即每個養殖桶共有3個凍存管。所有凍存管于-80℃保存。

檢測時，其中1個凍存管用于分析幼苗腸道菌群，采用16S rDNA高通量測序分析技術，由上海歐易生物醫學科技有限公司協助完成。另外2個凍存管用于分析幼苗腸道免疫指標。腸道組織化凍后，加入一定體積的預冷勻漿介質（Tris-HCl 0.01 mol·L-1，EDTA-Na20.1 mol·L-1，蔗糖 0.01 mol· L-1，NaCl 0.13 mol· L-1，pH 7.4），冰浴勻漿后，離心（8 000 r·min-1，15 min，4℃）取上清液用于測定腸道組織蛋白（intestinal tract protein）、免疫球蛋白 Ig M、白介素 IL-1β、干擾素IFN-α和腫瘤壞死因子TNF-α的含量。檢測使用購自南京建成生物工程研究所適合魚類檢測的試劑盒，并按其說明書進行。

1.5 數據分析

實驗數據均用平均值±標準差（Mean±SD）表示，存活率數據分析前經反正弦函數轉換。各組之間的差異顯著性用軟件Origin 8.0進行單因素方差（One-way ANOVA）分析。若有顯著差異，則繼續進行Tukey多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 養殖水體菌群

結果發現，加菌處理組中，養殖水體均含有大量的目標益生菌，確保了實驗益生菌粉能在養殖水體中活化和存活（表2）。另外，加菌處理組中，養殖水體的弧菌含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 各組養殖水體中弧菌、芽孢桿菌和乳酸菌的數量Tab.2 Number of Vibrio spp.，Bacillus spp.and lactic acid bacteria in aquaculture water（lg N cfu·m L-1）

2.2 存活和生長

不同益生菌配比對幼苗存活率影響顯著（One-way ANOVA，F9，29＝23.8，P＜0.05）。其中G組和I組的值最高，其均值均超過了65%；其次是A組、B組、C組和 H組，其均值為45% ～55%；以上6組均顯著高于對照組（≈40%）。存活率較低的是D組、E組和F組，其均值均低于35%，顯著低于對照組（P＜0.05）；另外，這3組的死亡個體絕大部分出現在實驗38～45 d這個時間段（圖1）。特定生長率除了B組和E組存在顯著差異外（P＜0.05），其他各組之間均無顯著差異（P＞0.05）；體高均由剛出生時的1 cm左右，經過 50 d，生長至（5.45±0.53）cm，其 SGR值為3.37±0.19（圖2）。

注：柱形圖上的不同小寫字母表示各組之間存在顯著差異（P＜0.05）Note：Different lowercase letters on the histogram indicate significant differences among treatments（P＜0.05）

圖2 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗特定生長率Fig.2 Specific grow th rate of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

2.3 腸道免疫及菌群

不同益生菌配比對幼苗腸道Ig M含量有顯著影響 （One-way ANOVA，F9，29＝26.4，P＜0.05），呈現出與存活率近乎一致的變化趨勢，表現為存活率低的組別（如D組、E組和F組），其IgM含量就低；而存活率高的組別（A組、B組、C組、G組、H組和I組），對應的Ig M含量就高（圖3）。而另 3個指標（IL-1β，IFN-α和 TNF-α），不同配比間差異亦顯著（P＜0.05），但其變化趨勢則與存活率、Ig M截然相反，表現為存活率低的組別（如D組、E組和F組）反而含顯著高的IL-1β、IFN-α和 TNF-α；而剩余其他組則含量相對偏低，變化幅度較小，并且趨于穩定水平（圖4～圖6）。

關于腸道菌群，各組之間變化較大。聚類分析結果表明，G組＆I組、A組＆B組＆C組、D組＆E組＆F組呈現出非常相近的菌群多樣性。相對豐度結果表明，在A組、B組、C組、G組、H組和I組這6組中，幼苗的腸道內含豐富的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、植物乳桿菌和約氏乳桿菌（L.johnsonii）；而在 D組、E組和 F組則相對匱乏。另外，A組和G組含相對較高的強壯弧菌（V.fortis）（圖7）。

圖4 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗腸道IL-1β含量Fig.4 IL-1βcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

圖5 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗腸道IFN-α含量Fig.5 IFN-αcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different p roportions

圖6 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后幼苗腸道TNF-α含量Fig.6 TNF-αcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

3 討論

作為益生菌，不管源于何地，必須在養殖動物腸道內能夠定植，或者在養殖水體中能夠存活，甚至繁殖，這是探討益生菌對水產養殖動物是否具有益生效果的先決條件［23］。鑒于目前市售的大部分益生菌，其菌源主要來源于陸生動物腸道，可能不適應海水環境或者水生動物腸道，因此，非常有必要檢驗實驗益生菌粉是否能在海馬養殖水體中存活或者在海馬腸道中定植。本文的水體菌群數據和腸道菌群數據表明，添加了益生菌后，水體中和海馬腸道內的益生菌含量顯著高于對照組，這個結果確保了實驗益生菌粉能在養殖水體中存活和在腸道中定植的前提。正如其他研究中報道的一樣［24-25］，添加益生菌后，水體中的弧菌顯著降低，這可能歸因于益生菌成了優勢菌群，從而在營養和空間層面抑制了弧菌［11］。但與其他研究不同的是，本文發現益生菌組的海馬腸道內的弧菌量沒有明顯抑制，反而部分明顯增加。而其他研究均一致表明添加了益生菌后，動物腸道內的弧菌量被明顯抑制［24-26］。這一截然不同的結果，可能歸因于實驗動物的餌料差異。其他實驗動物以配合飼料為主，而海馬以活餌橈足類為主［1-2］。橈足類身上攜帶有大量的弧菌［27-28］，因此越健康、攝食越旺盛的海馬其腸道內含橈足類就越多，相應地弧菌含量就高。在先前的研究中，筆者也嘗試通過抗菌藥物前處理橈足類以降低其弧菌攜帶量，進而投喂海馬來預防腸炎，結果顯示，短期內投喂消毒后的橈足類，海馬的生長存活表現明顯改善，但長期投喂易導致病害頻發，甚至較投喂未消毒橈足類的海馬更甚［28］。通過腸道菌群分析，筆者發現長期投喂消毒后的橈足類致使海馬腸道菌群發生很大變化，弧菌豐度雖顯著降低，但其他菌，特別是益生菌，亦顯著降低，菌群多樣性降低［28］。所以，海馬腸道內弧菌低，益生菌也低，則易發病；而弧菌高，益生菌也高，則不易發病，這一對比突顯了益生菌在維持海馬健康方面的作用。

圖7 3種益生菌（枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌）不同配比處理后各處理組幼苗腸道內菌群的分析結果（16S rDNA高通量測序）Fig.7 Intestinalm icrobiota of Hippocampus erectus juveniles at each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions（analysed by 16S rDNA sequencing analysis）

除了能抑制弧菌外，益生菌還可以提高養殖動物的免疫力，起到預防疾病的效果［8，18-22］。本文的存活率數據和腸道免疫指標數據也驗證了這一效果。Ig M、IL-1β、IFN-α和 TNF-α是機體非常重要的、與發病過程息息相關的免疫指標。Ig M通常作為抗病力的指示指標，高值往往代表著高的抗病能力；而 IL-1β、IFN-α和TNF-α通常作為炎癥的指示指標，高值往往代表著發炎或者感染的狀態［29-31］。本文結果顯示，高存活率的組別，其Ig M含量也高，這正驗證了高Ig M代表高抗病能力的觀點。而低存活率的組別，Ig M含量低，但 IL-1β、IFN-α和 TNF-α含量高，這也正說明了低存活率組別的幼苗抗病力低，正處于炎癥狀態。作為炎癥狀態的證據是：低存活率組別的幼苗死亡時間段集中在35～45 d，而指標檢測時間點（50 d）恰位于這個時間段附近。除了提高免疫力、增加抗病力的作用外，益生菌還有一個比較公認的作用是促生長［11］；而本文未見促生長作用，其原因可能跟海馬的攝食特點有關。海馬貪食，即使處于非健康狀態、甚至患病狀態，仍然大量進食。死亡的腸炎海馬中少見個體瘦癟的海馬，常見個體粗壯的海馬。從存活率數據和腸道免疫數據可以發現，枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌均能獨自改善灰海馬幼苗的養殖效果，但若將這3者混合起來使用，效果各異。復合菌有優于單菌的，如按2∶3∶1或3∶2∶1比例混合，但也有不及單菌的，如按 1∶2∶3、1∶3∶2或 2∶1∶3比例混合。這一結果表明，復合菌要想取得優于單菌的益生效果，單菌之間的配比至關重要。配比失衡，效果反而不及單菌。SALINAS等［19］研究表明，枯草芽孢桿菌和德氏乳桿菌乳酸亞種（L.delbrueckiisubsp lactis）聯合添加對金頭鯛的免疫提升效果要優于單菌添加。潘雷等［32］研究也表明，枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和異形雙歧桿菌（B.inopinatum）聯合添加對大菱鲆（Scophthalmusmaximus）的腸道弧菌抑制效果要優于單菌添加。以上兩篇報道所設定的混合比例只有1∶1一組。在多配比報道中，夏磊等［22］比較了鮑魚希瓦氏菌（Shewanell haliotis）、蠟樣芽孢桿菌和雙殼氣單胞菌（Aeromonas bivalvium）這3個益生菌9種復合比例對凡納濱對蝦生長、免疫及抗氨氮的效果，結果發現各比例效果各異，其中6∶1∶3促生長效果最好，4∶3∶1抗氨氮效果最佳。類似地，王姝等［33］則比較了沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudpmonas palustris）和枯草芽孢桿菌4種復合比例對池塘水質的改善效果，結果發現4∶1的比例最好。

從本文9個配比中發現，枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和糞腸球菌按2∶3∶1或3∶2∶1比例配搭時，效果最佳。從這兩個配比中可以推出，復合菌的益生效果可能是枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌起著主導作用，而糞腸球菌起輔助作用。糞腸球菌的比例一高，可能會抑制枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，或者產生拮抗作用。菌菌之間相互競爭而彼此不能繁殖；或者某菌繁殖，而另兩菌死亡敗壞，從而導致水體耗氧、亞氮增加，進而危及養殖動物［19］。