夾脊電針結合BWSTT干預脊髓損傷大鼠髓鞘超微結構及p-MLC的研究

何克林 ，胡蓉 ，馬睿杰 ，

(1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，杭州 310000;2.浙江中醫藥大學，杭州 310053)

脊髓損傷是一種破壞性極大的中樞神經系統疾病，由于脊髓結構受到破壞，導致神經沖動無法向下傳遞，從而出現運動功能障礙。近年來，隨著社會的快速發展，外傷性脊髓損傷的發病率有不斷上升的趨勢[1]。脊髓損傷后運動功能出現障礙，使患者癱瘓在床，無法活動，給患者和家庭帶來極大的壓力。在臨床上，電針對脊髓損傷具有較好療效[2]，減重步行訓練(body weight support treadmill training， BWSTT)是通過減輕脊髓損傷的下肢負重，以便更早地參與功能鍛煉的一種康復運動療法[3]。本研究通過制備外傷性脊髓損傷大鼠模型，探討電針聯合 BWSTT對磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain， p-MLC)和中樞髓鞘來源的神經生長抑制受體(Nogo-66 receptor，NGR)表達及髓鞘超微結構的影響以及運動功能恢復的可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

本實驗動物委托浙江中醫藥大學動物實驗中心購買[動物合格證書 SCXK(滬)2013-0016]。將 60只 SD成年雄性大鼠，體質量(200±20)g，編號1～60并導入SPSS軟件進行隨機分組，分為正常組、模型組、電針(EA)組、藥物組和 EA＋運動組，每組 12只，每組有連續治療7 d和14 d的2個亞組，每個亞組均有6只SD大鼠。本實驗嚴格遵守科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要實驗儀器與試劑

NYU脊椎沖擊損傷儀(美國健康醫療儀器國際公司型號NYU-2);冰凍切片機(microm HM550， Thermo);恒溫水箱(DK-600S型，上海精宏實驗設備有限公司);Mini-PROTEAN垂直電泳和轉膜系統(美國 Bio-Rad);華佗牌針灸針(0.18 mm×25 mm，蘇州醫療用品廠有限公司);HANS穴位神經刺激儀(HANS100A，南京濟生醫療科技有限公司);蛋白紫外分光光度計(德國Eppendorf);凝膠成像系統(Image Quant LAS4000型，德國 GE 公司);p-MLC(ab2480，美國 Abcam);NGR(ab174323，美國 Abcam);β-actin(ab179467，美國Abcam);BCA蛋白定量試劑盒(P0018，上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 模型制備

所有SD大鼠適應性飼養1周后，正常組僅手術切除椎板，不造成脊髓損傷，其余 4組均采取改良的Allen法制備脊髓損傷模型[4]。具體方法如下，將大鼠麻醉后俯臥位放置在恒溫動物臺上，先將SD大鼠四肢固定，再用手術切除大鼠脊柱 T10節段椎板，充分暴露脊髓，然后放置在美國NYU脊椎沖擊損傷儀上，參數設置為5 g×10 cm，通過下落的短桿垂直撞擊脊髓，造成脊髓組織的損傷。術后用脊髓損傷行為學評分(Basso-Beattie-Bresnahan rating scale， BBB 評分)評估造模成功與否，BBB評分在 3分以下的為造模成功。

1.4 治療方法

正常組和模型組僅常規觀察。

EA組選用華佗牌針灸針，取損傷部位的上下節段的夾脊穴，針刺深度以針尖觸及椎板為度，以同側上下夾脊穴為1組，連上韓式電針儀，設置頻率為2/100 Hz，留針20 min。每日治療1次。

藥物組予腹腔注射法舒地爾(Fasudil)[5]，劑量為10 mg/kg。每日治療1次。

EA＋運動組采用夾脊穴電針聯合 BSWTT進行干預。電針取穴、參數及方法同EA組。BSWTT具體流程是將減重裝置架設在活動平板(T1501)上，再將 SD大鼠放在活動平板上，分別用減重裝置上的前部夾子夾住大鼠的項背部皮膚，后部夾子夾住大鼠背部近鼠尾處，提起大鼠但不脫離活動平板，以減輕大鼠后肢負荷，然后啟動活動平板讓大鼠后肢隨平板轉動而進行步行訓練，活動平板的速度為8 m/min，每日減重步行訓練2次，每次訓練時間為5 min。

1.5 指標檢測

1.5.1 BBB評分

采用 BBB評分[6]觀察脊髓損傷大鼠的后肢運動功能恢復情況。連續治療7 d和14 d后，將脊髓損傷大鼠放進曠場，先讓大鼠適應性的爬行15 min，對照BBB評分表，通過觀察脊髓損傷大鼠后肢各關節的細微活動、步態以及精細運動情況進行評分，各時間點重復評估3次，每次評估間隔30 min，取3次BBB評分的平均值。

1.5.2 Western blot檢測

運用免疫印跡法檢測p-MLC和NGR的表達。大鼠麻醉后，手術分離損傷段脊髓，取脊髓組織稱重后置于緩沖液中，低溫勻漿，離心取上清液，用 Loary法測定蛋白含量，用于免疫印跡檢測。將提取的脊髓組織蛋白(50 μg)加2×SDS上樣緩沖液經變性10 min，上樣于8% SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳2 h后轉膜，將膜與一抗p-MLC(1:1000)、NGR(1:1000)結合，放入4℃冰箱孵育過夜，然后與二抗(1:5000)結合，于室溫條件下孵育1 h，顯色壓片后使用Bandscan5.0軟件分析條帶的光密度值，每個條帶重復測量3次。目標蛋白的相對表達=目的蛋白(光密度值)/內參β-actin(光密度值)。

1.5.3 髓鞘染色

用髓鞘染色(luxol fast blue stain， LFB染色)觀察脊髓損傷大鼠的髓鞘結構。各組大鼠取脊髓組織制作冰凍切片，經蒸餾水清洗后，放入0.1% LFB溶液，于 60℃密封過夜，再次用蒸餾水、95%乙醇清洗，放入碳酸鋰溶液30 s，70%乙醇30 s。直至顯微鏡下觀察灰、白質區分清晰為止。再用蒸餾水沖洗，甲苯酚紫復染30～40 s，再次用蒸餾水沖洗，95%乙醇 5 min(鏡檢)，100%乙醇2×5 min，二甲苯2×5 min，中性樹膠封片觀察。

1.6 統計學方法

采用SPSS21.0軟件處理和分析，符合正態分布的數據用均數±標準差表示。各組組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時，兩兩比較用最小顯著差法(LSD-t)檢驗;若方差不齊，則采用Dunnett’s檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BBB評分

脊髓損傷后大鼠后肢運動功能明顯減弱，BBB評分結果顯示，治療7 d后，EA＋運動組BBB評分與模型組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。治療 14 d后，EA＋運動組BBB評分較前升高，與模型組和EA組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠治療后7 d、14 d BBB評分比較 (±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與EA組比較3)P＜0.05;與藥物組比較4)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 21±0 21±0模型組 12 1.83±1.171) 8.00±0.891)EA組 12 5.83±0.751)2) 12.17±1.321)2)藥物組 12 8.33±1.031)2)3) 14.67±1.211)2)3)EA＋運動組 12 6.83±1.161)2)4) 14.00±1.091)2)3)

2.2 p-MLC蛋白表達

脊髓損傷后大鼠 p-MLC表達明顯增多，治療 7 d后， EA＋運動組p-MLC表達與模型組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。治療14 d后，EA＋運動組p-MLC表達較前減少，與模型組和 EA組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠治療后7 d、14 d p-MLC表達比較 (±s)

表2 各組大鼠治療后7 d、14 d p-MLC表達比較 (±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與EA組比較3)P＜0.05;與藥物組比較4)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 0.17±0.07 0.16±0.08模型組 12 2.01±0.201) 1.69±0.161)EA組 12 1.17±0.141)2) 0.81±0.051)2)藥物組 12 0.84±0.071)2)3) 0.67±0.051)2)3)EA＋運動組 12 1.02±0.141)2)4) 0.62±0.051)2)3)

圖1 各組大鼠治療后7 d、14 d p-MLC的表達

2.3 NGR蛋白表達

脊髓損傷后NGR表達明顯增多，治療7 d后，EA＋運動組 NGR表達與模型組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。治療14 d后，EA＋運動組NGR表達較前減少，與模型組和 EA組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠治療后7 d、14 d NGR表達比較 (±s)

表3 各組大鼠治療后7 d、14 d NGR表達比較 (±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與 EA組比較3)P＜0.05;與藥物組比較4)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 0.12±0.03 0.13±0.06模型組 12 1.18±0.161) 1.15±0.081)EA組 12 0.94±0.161)2) 0.86±0.091)2)藥物組 12 0.70±0.051)2)3) 0.65±0.071)2)3)EA＋運動組 12 1.02±0.151)2)4) 0.77±0.071)2)3)4)

圖2 各組大鼠治療后7 d、14 d NGR的表達

2.4 LFB染色

脊髓損傷后，軸突髓鞘結構遭到破壞，脊髓白質纖維紊亂，髓鞘缺失，有髓神經纖維較少，髓鞘染色平均IOD值下降明顯。治療7 d后，EA＋運動組平均IOD值與模型組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)，治療14 d后，EA＋運動組平均IOD值較前升高，與模型組和EA組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠治療后7 d、14 d LFB染色表達比較(±s)

表4 各組大鼠治療后7 d、14 d LFB染色表達比較(±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與 EA組比較3)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 7226.52±574.42 6915.04±278.82模型組 12 3830.76±458.251) 3923.02±274.931)EA組 12 4824.98±316.371)2) 5030.47±575.331)2)藥物組 12 5341.76±218.091)2)3) 5690.89±451.951)2)3)EA＋運動組 12 4888.84±237.861)2) 5655.58±313.231)2)3)

圖3 各組大鼠治療后7 d、14 d髓鞘染色(×400)

3 討論

3.1 中醫學對脊髓損傷的認識

脊髓損傷后可見下肢痿弱無力，影響隨意運動。中醫學將其歸屬于“痿證”范疇，相關描述最早可見于《靈樞·寒熱病》:“身有所傷……若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰。”脊髓是督脈循行之處，督脈主人體一身之陽氣，外力撞擊致脊髓結構形變，則督脈受損，瘀血阻絡，督脈之氣血運行不利，則肢體失養，發為痿證。治療上，需疏通瘀阻之督脈，促進督脈氣血運行，肢體得以氣血濡養，則痿證向愈。夾脊穴內夾督脈，可疏通督脈之氣血，使督脈之氣能上下貫通。

3.2 夾脊電針結合 BWSTT對脊髓損傷運動功能的作用

脊髓損傷后運動功能遭到破壞，導致患者癱瘓在床，長此以往，會進一步出現一系列并發癥。夾脊穴位于脊神經的后支上，多項研究證實夾脊穴電針可促進脊髓損傷后運動功能的恢復[7-9]。減重步行訓練是一種運動療法，可用于脊髓損傷后下肢功能恢復[10-12]。由于脊髓損傷后，患肢肌力明顯下降，還不能支撐自身重力，滿足行走需要。減重步行訓練通過減輕下肢負重，可讓患者更早地參與行走。BBB評分是評價大鼠后肢運動功能恢復的常用指標，廣泛應用脊髓損傷后肢體運動功能的評估[13-14]。本實驗研究通過電針結合BWSTT，BBB評分結果顯示，在連續治療14 d后，EA＋運動組的BBB評分優于EA組，說明二者聯合應用能促進運動功能恢復。

3.3 電針結合BWSTT對脊髓損傷大鼠MLC磷酸化調節

肌球蛋白輕鏈(myosin light chains， MLC)是RhoA/ROCK信號的下游底物，RhoA/ROCK信號激活后能對下游底物 MLC磷酸化，刺激肌球蛋白與肌動蛋白的交聯，進而增強肌動蛋白的收縮，調節細胞骨架的重組，導致生長錐塌陷，神經元突起縮回，使軸突的生長受到抑制[15]。NGR是位于胞膜外的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白，中樞髓鞘來源的神經生長抑制因子均需要與NGR結合，發揮抑制髓鞘生成的作用[16-17]。Fasudil是ROCK激酶抑制劑，具有競爭性拮抗作用，與ATP位點結合，抑制ROCK激酶活性，調節MLC和NGR的表達，促進軸突再生和神經功能恢復[18-20]。本研究發現，脊髓損傷后，p-MLC、NGR表達均明顯增多，電針結合BWSTT組的MLC磷酸化較模型組表達少，說明電針結合BWSTT可能通過抑制ROCK活性，進而減少MLC磷酸化和中樞髓鞘來源的神經生長抑制因子受體NGR的表達。

3.4 電針結合 BWSTT對脊髓損傷大鼠髓鞘超微結構的影響

髓鞘結構是神經元軸突表面包裹的富含脂類的多層質膜，可調節神經元的傳導速率，維持神經系統的穩定性，以及運動、認知及情感等高級神經功能具有重要作用[21-23]。脊髓損傷后，神經元軸突脫髓鞘性改變，神經傳導受到影響，運動功能遭到破壞。本研究發現，脊髓損傷后，脊髓白質纖維紊亂，髓鞘缺失，有髓神經纖維較少，髓鞘染色平均IOD值下降明顯，說明髓鞘參與脊髓損傷后神經功能恢復，電針＋運動組的髓鞘染色平均IOD值較模型組增多，說明電針結合BWSTT能干預髓鞘再生，促進脊髓損傷后神經功能恢復。在治療14 d后，電針＋運動組的髓鞘染色平均 IOD值優于 EA組，提示隨著治療時間的延長，電針結合 BWSTT更具有優勢。

綜上，電針結合 BWSTT可能通過抑制脊髓損傷后MLC的磷酸化及中樞髓鞘來源的神經生長抑制受體NGR的表達，保護髓鞘結構，促進運動功能恢復。