“雙固一通”艾灸法對糖尿病及糖尿病周圍神經病變大鼠海馬BDNF和NT-3蛋白的影響

曾林 ，向婷 ，王天沛 ，胡霞 ，唐宏圖 ，4

(1.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，武漢 430061;2.中國解放軍廣州軍區武漢總醫院，武漢 430070;3.湖北中醫藥大學基礎醫學院，武漢 430065;4.針灸治未病湖北省協同創新中心，武漢 430061)

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是胰島素分泌的缺陷或(和)胰島素作用障礙所導致的一組以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。DM以高血糖為主要標志，誘發各種嚴重的并發癥，是DM致死、致殘的主要原因[1]。DM已成為全世界許多國家的常見病和多發病，其病死率已居腫瘤、心血管病之后的第3位，是工業發達國家中僅次于癌癥、艾滋病和心血管疾病之后需優先考慮的疾病[2]。據國家衛生部調查顯示，我國每天新增 DM患者3000例，每年約增加120萬[3]。糖尿病周圍神經病(diabetic peripheral neuropathy， DPN)是 DM 常見并發癥，近年來，隨著DM發病率的提高，其周圍神經病變的發病率也明顯增多。據統計，DPN的發生率高達60%～90%[4]。有相關研究表明，糖尿病患者體內缺乏神經營養因子及其相關受體，從而導致了 DPN的發生[5]。而且另有學者指出，神經營養因子在神經修復的過程中起著重要作用[6]，因此缺乏此類因子也是多數神經損傷不可逆轉的主要原因之一。本實驗通過對DM、DPN大鼠血糖及其海馬組織的腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)和神經營養素-3(neurotrophin-3， NT-3)蛋白表達的觀察，擬探討艾灸對防治DM及DPN的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇的 SPF級雄性 SD大鼠 105只，體質量為(200±20)g(3月齡)，實驗動物由湖北中醫藥大學實驗動物中心[實驗動物許可證號 syxk(鄂)2017-0067]提供。適應性喂養1周，再行實驗，實驗過程完全符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定。

1.2 主要試劑及儀器

鏈尿佐菌素(S0130，Sigma公司，美國)，BDNF抗體(ab108319，Abcam 公司，美國)，NT3 抗體(ab216491，Abcam公司，美國)，KD-YS3A生物組織自動脫水機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)，KL-Ⅰ型生物組織自動包埋機(湖北康龍電子科技有限責任公司)，Finesse325旋轉石蠟切片機(美國賽默飛世爾科技有限公司)，BX53型生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，AWL-1001-M艾科浦超純水機(美國艾科浦國際有限公司)，動物實驗用艾條(河南南陽漢方艾葉有限公司)，ONE TOUCH穩豪?倍易型血糖儀(美國強生公司)，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(武漢千屏影像技術有限公司)。

1.3 模型制備

采用隨機數字表法隨機選取 15只大鼠作為正常對照，另90只大鼠禁食不禁水12 h后，左下腹腔注射鏈脲佐菌素[7]，劑量為 50 mg/kg體質量。注射完成后72 h開始測血糖，凡血糖水平在16.7 mmol/L以上者列為DM模型大鼠[8]。

1.4 實驗分組和處理

從造模成功的75只DM模型大鼠中采用隨機數字表法隨機抓取30只，并再次采用隨機數字表法均分為B組和C組，每組15只;剩余45只DM模型大鼠繼續正常喂養4周，測定感覺或運動傳導速度減慢超過11%即成DPN大鼠模型[9]，共30只，再采用隨機數字表法隨機均分為D組和E組，每組15只。

A組:正常對照，不造模，不治療。

B組:DM模型組，造模成功后不行艾灸治療，正常喂養。

C組:DM艾灸治療組，造模成功后，取大鼠關元，雙側足三里、胰俞穴[10]，用0.5 cm×15 cm的實驗動物用艾條對各穴位先后進行懸灸，艾條距離穴位約5 cm，每穴15 min，每日1次，連續治療4周后取材檢測。

D組:DPN模型組，不行艾灸治療，正常喂養。

E組:DPN艾灸治療組，治療方法同C組。

1.5 指標觀察與檢測

1.5.1 血糖檢測

于造模后72 h、4周治療結束后和8周治療結束后空腹尾靜脈采血，用強生血糖儀及配套試紙檢測血糖。

1.5.2 BDNF和NT-3蛋白免疫組化檢測

4周治療結束后和8周治療結束后，用10%水合氯醛將各組大鼠麻醉，迅速斷頭取大腦，剝離海馬部分置于4%的多聚甲醛固定液中固定。常規石蠟包埋、切片，貼片后于60℃烘片3 h備用。

免疫組化DAB法檢測海馬組織BDNF和NT-3蛋白的表達水平，具體步驟為脫蠟，PBS浸洗3 min×3次，用微波輻射抗原修復法進行抗原修復，而后等待其自然降至常溫，用 0.3%過氧化氫甲醇液阻斷內源性過氧化物酶，PBS浸洗 5 min×3次，10%正常山羊血清室溫封閉10 min，甩去血清滴加1:250倍稀釋的兔抗BDNF、NT-3單/多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS浸洗5 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗IgG多聚體，37℃孵育45 min，PBS浸洗5 min×3次。用新鮮配制的DAB顯色液顯色，在顯微鏡下控制顯色時間，用PBS終止反應，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，水洗返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片晾干，鏡檢拍照。圖片分析采用 HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統進行圖像分析。每鼠取切片5張，400倍鏡下檢測各片的平均光密度值(density)，分別測定，累加取其平均值，即為該鼠density值。終值單位為像素點，檢測場面積為15萬個像素點。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS19.0統計軟件進行處理。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，各組治療前后比較運用配對樣本t檢驗，組間比較運用單因素方差分析。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠治療前后血糖比較

B組、D組與 A組比較，血糖水平明顯升高(P＜0.05);C組與B組比較，大鼠在治療后血糖水平均降低(P＜0.05);E組與D組比較，大鼠在治療后血糖水平均降低(P＜0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較 (±s，mmol/L)

表1 各組大鼠治療前后血糖比較 (±s，mmol/L)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與D組比較3)P＜0.05

組別 n 72 h 4 w 8 w A 組 15 4.78±0.83 5.14±1.08 5.08±0.93 B組 15 19.23±1.421) 23.25±2.181) -C組 15 21.34±2.061) 13.68±2.891)2) -D 組 15 21.73±3.151) 23.58±2.191) 26.39±2.371)E 組 15 20.65±2.721) 22.46±3.481) 13.87±2.571)3)

2.2 各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達比較

正常大鼠海馬BDNF蛋白陽性表達呈棕色，B組和D組大鼠陽性表達均減少，經“雙固一通”灸法防治后，C組和E組大鼠的BDNF蛋白陽性表達均明顯增加，詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達比較(×400)

表2 各組大鼠BDNF免疫陽性神經元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

表2 各組大鼠BDNF免疫陽性神經元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與D組比較3)P＜0.05

組別 n 4 w 8 w A組 15 24.36±0.15 24.87±0.34 B組 15 12.16±0.081) -C組 15 18.52±0.432) -D組 15 - 9.56±1.321)E組 15 - 16.58±0.643)

B組、D組大鼠海馬BDNF免疫陽性神經元平均光密度值較A組明顯減少(P＜0.05);與B組比較，C組大鼠 BDNF免疫陽性神經元平均光密度值明顯增加(P＜0.05);與D組比較，E組大鼠BDNF免疫陽性神經元平均光密度值明顯增加(P＜0.05)，詳見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織NT-3蛋白表達比較

正常大鼠NT-3蛋白陽性表達呈棕色，B組和D組大鼠陽性表達均減少，經“雙固一通”灸法防治后，C組和E組大鼠的NT-3蛋白陽性表達均明顯增加，詳見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織中NT-3蛋白表達比較(×400)

B組、D組大鼠海馬NT-3免疫陽性神經元平均光密度值較A組明顯減少(P＜0.05);與B組比較，C組大鼠 NT-3免疫陽性神經元平均光密度值明顯增加(P＜0.05);與D組比較，E組大鼠NT-3免疫陽性神經元平均光密度值明顯增加(P＜0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠NT-3免疫陽性神經元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

表3 各組大鼠NT-3免疫陽性神經元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與D組比較3)P＜0.05

A組 15 38.56±0.05 38.34±0.32 B組 15 11.32±0.061) -C組 15 24.51±0.232) -D組 15 - 8.68±0.821)E組 15 - 20.36±0.583)

3 討論

中醫學將糖尿病(DM)稱之為“消渴”。糖尿病周圍神經病(DPN)在古醫籍中無確切的病名，但長期以來DPN與“消渴”都是密切聯系在一起的。《黃帝內經》時期已對消渴的病因、病機、癥狀等有了較為詳細的記載。《內經》明確地指出消渴病因為“此肥美之所發也，引人必數食甘美多肥也。肥者令人內熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴”，這些論述與現代醫學研究認為飲食失控可誘發糖尿病的理論十分吻合。唐初著名醫家甄立言《古今錄驗方》記載消渴臨床癥狀為“渴而飲水多，小便數，無脂似麩片甜”，王燾在《外臺秘要》中指出“消渴者，每發小便至甜”。《素問·太陰陽明論》:“脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟水谷之氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉皆元氣以生。”說明 DPN的臨床表現是以四肢麻木不仁為主;而脾虛化生津液不足，營陰虧耗，從而引起氣血虧虛，不能濡養筋脈而導致四肢不溫而痛;氣虛血行不暢，久而成瘀。

中醫學“治未病”以正氣為本，固護先天和后天是其基礎和關鍵，通過“治”達到“防”的目的，“治”是積極的、主動的“防”。“防”的意義有三，一是預防疾病，二是療疾防變，三是調節機能。中醫學“治未病”的本質特征是“固護正氣、以治為防”[11]。“雙固”即固護人體先天之本和后天之本，“一通”即通瀉病邪。足三里為胃經合穴，胃腑之下合穴，針之可調理脾胃，補益氣血生化之源，固護后天之本;關元為任脈腧穴，也是三陰經與任脈交會穴，為元陰、元陽關藏出入之所，針之可益精補氣，扶助人體先天之本。足三里、關元配合，兼顧先天和后天，補益正氣，再與治療消渴的效穴胰俞相配伍，則可達到以治為防、防微杜漸的目的[12]。“雙固一通”針灸法以中醫發病學和防治學理論為基礎，堅持“未病先防，既病防變”的治療原則，注重調動機體整體的潛在能力，以治為防，防治結合[13]。

灸法在對 DM及其并發癥的防治方面也有極為豐富的記載。古文獻《千金翼方》載:“消渴咽喉干，灸胃管下俞三穴各百壯，穴在背第八椎下橫三寸，間寸灸之。”又有“食不充饑灸三里”之說。在現代臨床研究方面，對DPN患者采用雷火灸法[14-15]、溫針灸[16]可明顯改善患者的生活質量。也有學者發現，在治療 DPN上，運用溫和灸治療后患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、一氧化氮、丙二醛和血漿內皮素均有明顯改善，且與西藥組有明顯差異[17]。亦有報道稱通過溫針灸法可以顯著改善DPN患者中醫證候積分、Toronto量表評分，提高神經傳導速度[18]。在現代動物實驗方面，趙永等[19]觀察到“雙固一通”灸法可對模型大鼠的血清中的TNF-α和 IL-6的含量起到良性調節的作用。另有學者[20-21]研究表明艾灸可更有效地清除自由基，發揮胰島素(INS)的作用，改善患者的代謝狀態。

神經營養因子(neurotrophic factors， NTFs)是一類在靶組織內合成，并逆行運輸至效應神經元的能對中樞和周圍神經發揮營養作用的小分子肽類物質和蛋白質[22]。而NTFs的缺乏被認為是DPN的發生的主要原因[23]。在神經營養因子家族中神經生長因子(NGF)研究較多，其功能為維持神經的功能和形態、修復神經損傷，還能促進胰島的正常發育和功能維持，當DPN發生時，體內 NGF水平下降，引起神經軸突運轉異常，影響神經正常功能[24]。近來發現腦源性神經營養因子(BDNF)和神經營養素-3(NT-3)對中樞和周圍神經組織有廣泛作用，對神經元發育有促進作用，并能使受損神經元免于凋亡[25]。BDNF和NT-3是神經營養因子家族中重要成員，它們與NGF有50%同源性[26]。BDNF對在體運動神經元發育、成年后運動神經元存活及病變運動神經元存活和軸突再生有著十分重要的作用[27-30]。李昌琪等[31]在小鼠坐骨神經壓榨損傷后，腹腔注射 BDNF抗體中和內源 BDNF，證實了小鼠坐骨神經損傷后內源性BDNF可參與脊髓前角運動神經元內突觸素Ⅰ mRNA表達的調節。張力等[32]也發現內源性BDNF對周圍神經的再生和髓化起重要作用。在Wobler小鼠模型中(運動神經元疾病)，外源性BDNF可阻滯運動功能失調，并減少去神經支配的肌肉萎縮和運動神經元軸突的丟失。因此，BDNF在受損運動神經元的修復中起重要作用[33]。NT-3主要分布在大腦海馬，在骨骼肌中也大量存在，對支配肌肉的感覺神經元和運動神經元都發揮著營養作用。NT-3可以調節神經元的活動以及促進損傷神經的修復，NT-3缺乏或含量不足時，會對學習記憶等功能產生影響，并與阿爾茨海默病等神經退行性病變密切相關。以往的許多研究已證實DM可以引起周圍神經系統NT-3合成和運輸下降[34]。NT-3能夠促進神經元存活，阻止神經元損傷后死亡，促進神經元修復和調節神經遞質傳遞等功能，并可以逆轉受損神經元的萎縮，使損傷部位存活的神經元增多[35]。

本實驗結果顯示，通過“雙固一通”艾灸法治療后，模型大鼠的血糖明顯下降，發揮了其降糖的作用，而且發現模型組大鼠海馬中BDNF和NT-3蛋白表達的數量明顯降低，DM及 DPN嚴重損傷了大鼠神經功能;而 DM和DPN治療組中，二者BDNF和NT-3蛋白的表達顯著增加，因此，“雙固一通”艾灸法通過影響BDNF和NT-3的產生，保護糖尿病大鼠的感覺神經元，對糖尿病及并發癥周圍神經病變起到治療作用。