電針對PSD大鼠前額葉和海馬BDNF、CREB表達調控的影響

徐鳴曙 ，張衛 ，張杏林 ，張英杰 ，張荻 ，程愛芳

(1.上海市針灸經絡研究所，上海 200030;2.廈門市中醫院，福建 361009;3.上海中醫藥大學，上海 201203)

卒中后抑郁(post stroke depression， PSD)是卒中后最常見的精神神經并發癥[1]，大約 30%～50%的患者在卒中后出現焦慮或抑郁問題[2]。PSD損傷患者認知功能[3]，妨礙患者肢體功能恢復，增加卒中患者的死亡率和致殘率[4]，極易出現“因病致郁”“因郁致病”的惡性循環。PSD的發生與單胺類神經遞質功能紊亂、細胞炎性因子、神經細胞的損傷和凋亡有關[5-8]。鹽酸氟西汀作為治療PSD的臨床一線藥物，屬于選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors， SSRIs)，能使體內 5-羥色胺保持較高含量，產生抗抑郁作用，常被用于抗抑郁的對照研究[9]。

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)，是神經元再生的關鍵因子[10]，維持神經元的生存、生長和分化，提高單胺遞質水平[11]。環磷腺苷反應元件結合蛋白(cyclic-AMP response element binding protein， CREB)是核轉錄因子家族中的一員，調節促細胞生存、生長、分化和神經可塑性的基因表達[12]，促進BDNF的轉錄[13]。BDNF和CREB在PSD中的作用日益受到研究者的重視， Cao K等[14]研究發現，PSD大鼠海馬中同時存在BDNF、CREB表達下降，使用抗抑郁藥能夠逆轉這一過程。本研究觀察電針干預后，PSD模型大鼠行為學改變以及前額葉和海馬BDNF、CREB表達的變化，通過與氟西汀的對比，揭示針刺干預PSD的作用特點，為臨床防治PSD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級SD大鼠40只，體質量(250±20)g，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心提供[實驗動物許可證號為 SYXK(滬)2013-0109]，室溫(24±2)℃，濕度 40%～70%，明暗光照交替 12 h/12 h，適應性飼養1周后進行實驗。實驗方法符合國際獸醫學編輯協會《關于動物倫理與福利的作者指南共識》，經過上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院倫理委員會審查。

1.2 主要儀器

0.25 mm×25 mm一次性針灸針(吳江市云龍醫療器械有限公司);100 cm×100 cm×50 cm木制無蓋敞箱(香港友誠生物科技有限公司);Fresco21臺式高速冷凍離心機(Thermo);Mutiskan GO全波長酶標儀(Thermo);POWER PAC 3000伯樂電泳儀(BIO RAD);GIS-1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司);Roche480Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche)。

1.3 藥品與試劑

鹽酸氟西汀膠囊(Patheon france);0.9%氯化鈉注射液(浙江濟民制藥股份有限公司);CREB(48H2)Rabbit mAb(Cell signaling technology);RNA酶抑制劑(Invitrogen);Anti-BDNF antibody(3B2)(英國Abcam)。

1.4 模型制備

1.4.1 大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型制作

參照本課題組報道[15]的線栓法 MCAO模型進行造模。造模前大鼠禁食不禁水 12 h。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，做頸部正中切口，鈍性分離出右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。結扎頸外動脈遠心端，用動脈夾夾閉頸總動脈和頸內動脈。在頸外動脈近心端距離分叉2～3 mm穿1根4號縫合線并打一虛結，在頸外動脈遠心端結扎處和虛結之間處剪一小口，插入栓線后，系緊虛結，松開動脈夾，剪斷頸外動脈，將栓線推入頸內動脈，長度約 18 mm。逐層縫合，乙醇棉球消毒。保溫，復蘇，90 min后進行再灌注，將栓線拔出至有阻力，剪掉露出皮膚外面的栓線。

1.4.2 大鼠PSD模型制作

采用慢性不可預知應激抑郁癥(CUMS)模型[16]，在MCAO模型大鼠術后第2天，相繼給予慢性溫和不可預知應激處理，包括夾尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、束縛5 min、晝夜顛倒24 h、45℃烘箱熱刺激5 min、4℃冰水游泳5 min。每日隨機采用1種方法應激大鼠，同一種方法在同一個周期(7 d)內不重復出現，連續應激21 d。

1.5 實驗分組及干預方法

大鼠適應性喂養 1周后，禁水 24 h，進行曠場(Open-Filed)實驗。將評分相近的大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥組和電針組，每組10只。正常組孤養不作任何處理，其余各組在PSD模型制備成功后第2天給予相應處理。模型組大鼠給予 2 mL 0.9%生理鹽水灌胃，連續 21 d。西藥組大鼠給予鹽酸氟西汀溶液(0.2 mg/kg鹽酸氟西汀溶于2 mL生理鹽水中[17])灌胃，連續21 d。電針組大鼠予以電針治療，取百會、豐隆、太沖、三陰交(穴位定位參照李忠仁主編《實驗針灸學》[18])，百會斜刺進針，余穴直刺，使用韓氏電針治療儀，針柄接豐隆、太沖，頻率 2 Hz，電流強度以大鼠耐受，兩耳微微震動為宜。每日治療 30 min，連續治療21 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠神經功能缺損評分

本研究采用 Menzies[19]改進評分法在造模前、造模后2 h、造模后24 h、應激21 d后和治療21 d后對大鼠進行神經缺損評分。大鼠左前肢出現肩或(和)肘內收屈曲，肩關節內旋，或者肩肘關節屈曲同時伴有內旋者，計為1分，無此現象則計為0分;大鼠左前肢阻力減小或(和)行走偏左側，或(和)向左側轉圈，計為 1分，無此現象則計為 0分;大鼠左前肢肌張力下降，計為1分，無此現象則計為0分;大鼠不停地向腦損傷對側一個方向旋轉者，計為1分，無此現象則計為0分。滿分為4分，1～4分為有效模型。

1.6.2 大鼠體質量

分別于應激0 d、應激21 d后、治療21 d后記錄大鼠體質量。

1.6.3 大鼠行為學觀測

1.6.3.1 曠場實驗

分別于應激0 d、應激21 d后、治療21 d后進行曠場實驗，測試動物的自發活動情況及其對開闊環境的焦慮行為。將長寬均為100 cm、高50 cm，底面和四周均為黑色的無蓋木質敞箱底面劃分為 16個面積為25 cm×25 cm的小方格，將大鼠放在敞箱中心位置，觀察其在3 min內活動情況，以穿越地面方塊數作為水平運動得分，后肢直立次數作為垂直運動得分[20]。水平運動主要反映動物的活動度，垂直運動則反映了動物對新環境的探索情況。

1.6.3.2 糖水試驗

分別于應激0 d、應激21 d后、治療21 d后進行糖水消耗試驗，以檢測動物對獎賞的反應性。將大鼠禁食禁水8 h后，同時給予已稱重的2%蔗糖水和蒸餾水各1瓶，24 h后調換蔗糖水和純水的位置，48 h后再次對兩瓶進行稱重。大鼠糖水消耗量(%)=蔗糖水飲用量/(蔗糖水飲用量＋蒸餾水飲用量)×100%[21]。

1.6.4 大鼠前額葉和海馬 BDNF、CREB、BDNF mRNA、CREB mRNA表達

治療結束后，每組隨機選取6只大鼠斷頭取腦，在冰盤上迅速分離出前額葉和海馬，置于凍存管中，-80℃保存。Western blot檢測BDNF、CREB蛋白水平，每20 mg腦組織加入100 μL裂解液，在勻漿機中充分裂解后，12000 rpm，離心5 min;取上清蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，配膠，轉膜(200 mA，70 min);加入二抗(Jackson 1:2000)，4℃孵育過夜;TBST洗膜，于化學發光檢測試劑反應2 min;暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

RT-PCR檢測BDNF mRNA、CREB mRNA的表達。提取腦組織總RNA，根據試劑盒操作說明，進行逆轉錄反應，熒光定量PCR擴增。引物序列為5’-GCG GCA GAT AAA AAG ACT GC-3’，5’-GCA GCC TTC CTT CGT GTA AC-3’，5’-ACC AGC AGA GTG GAG ATG CT-3’，5’-GGG CTA ATG TGG CAA TCT GT-3’。冰上配制PCR反應液體，3次獨立實驗后得到的數據進行分析。

1.7 統計學方法

采用 SPSS24.0統計軟件對相關數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析;不滿足正態分布計量資料采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

造模前，各組大鼠神經功能缺損評分比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。MCAO造模后2 h、MCAO造模后24 h、應激21 d后，模型組、西藥組、電針組大鼠神經功能缺損評分顯著升高(P＜0.05)，提示 MCAO模型制備成功。治療21 d后，西藥組、電針組大鼠神經功能缺損評分較模型組顯著降低(P＜0.05)。詳見表1。

2.2 各組大鼠體質量比較

應激 0 d，各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。應激21 d后，模型組、西藥組、電針組大鼠體質量均明顯低于正常組(P＜0.05)。治療 21 d后，西藥組、電針組大鼠體質量較模型組明顯升高(P＜0.05)，但仍低于正常組(P＜0.05);西藥組和電針組大鼠體質量比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 (±s，分)

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 (±s，分)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與西藥組比較 3)P＜0.05;與電針組比較 4)P＜0.05;與造模前比較 5)P＜0.05

組別 n 造模前 MCAO造模后2 h MCAO造模后24 h 應激21 d后 治療21 d后正常組 10 0.00±0.00 0.00±0.002)3)4) 0.00±0.002)3)4) 0.00±0.002)3)4) 0.00±0.002)3)模型組 10 0.00±0.00 2.13±0.841)5) 2.25±0.711)5) 1.25±0.461)5) 1.13±0.641)3)4)5)西藥組 10 0.00±0.00 2.25±0.711)5) 2.38±0.741)5) 1.38±0.741)5) 0.63±0.521)2)5)電針組 10 0.00±0.00 2.00±0.761)5) 2.13±0.991)5) 1.13±0.841)5) 0.38±0.522)

表2 各組大鼠體質量比較 (±s，g)

表2 各組大鼠體質量比較 (±s，g)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與西藥組比較3)P＜0.05;與電針組比較4)P＜0.05

組別 n 應激0 d 應激21 d后 治療21 d后正常組 10 273.94±12.70 390.44±9.49 459.44±11.822)3)4)模型組 10 273.38±4.57 348.00±29.901) 418.06±12.041)3)4)西藥組 10 283.75±8.53 347.56±12.671) 432.94±8.861)2)電針組 10 276.00±19.29 344.19±12.661) 434.06±6.041)2)

2.3 各組大鼠曠場實驗得分比較

應激 0 d，各組大鼠曠場實驗得分比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。應激21 d后，模型組、西藥組、電針組大鼠曠場實驗水平運動和垂直運動得分顯著降低(P＜0.05)。治療21 d后，模型組大鼠曠場實驗水平運動和垂直運動得分持續降低(P＜0.05);西藥組、電針組大鼠曠場實驗水平運動和垂直運動得分較模型組和應激21 d時明顯升高(P＜0.05);西藥組和電針組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠曠場實驗得分比較 (±s，分)

表3 各組大鼠曠場實驗得分比較 (±s，分)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與西藥組比較3)P＜0.05;與電針組比較4)P＜0.05;與應激0 d比較5)P＜0.05;與應激21 d后比較6)P＜0.05

組別 n 應激0 d 應激21 d后 治療21 d后水平 垂直 水平 垂直 水平 垂直正常組 10 35.67±16.42 4.88±2.64 24.00±7.802)3)4)5) 3.63±1.192)3)4)5) 29.88±9.372) 3.29±1.602)模型組 10 33.60±15.39 5.00±2.73 14.63±7.931)5) 1.88±1.731)5) 12.75±5.701)3)4)5)6) 1.14±1.571)3)4)5)6)西藥組 10 35.70±17.65 4.57±1.40 16.11±7.521)5) 1.67±1.371)5) 24.13±7.682)6) 2.86±1.862)6)電針組 10 33.71±16.76 4.75±2.66 15.50±9.481)5) 1.71±1.501)5) 26.71±8.622)6) 2.88±1.132)6)

2.4 各組大鼠糖水消耗量比較

應激0 d，各組大鼠糖水消耗量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。應激21 d后，模型組、西藥組、電針組大鼠糖水消耗量均明顯降低(P＜0.05)。治療 21 d后，西藥組、電針組大鼠糖水消耗量較模型組明顯升高(P＜0.05)，接近正常水平;西藥組和電針組大鼠糖水消耗量比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠糖水消耗量比較 (±s，%)

表4 各組大鼠糖水消耗量比較 (±s，%)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與西藥組比較3)P＜0.05;與電針組比較4)P＜0.05;與應激0 d比較5)P＜0.05;與應激21 d后比較6)P＜0.05

組別 n 應激0 d 應激21 d后 治療21 d后正常組 10 87.59±7.08 90.10±7.222)3)4) 90.49±6.042)模型組 10 88.36±6.99 79.68±9.191)5) 78.52±5.611)5)西藥組 10 86.91±5.17 78.51±11.301)5) 86.32±8.462)6)電針組 10 87.94±10.06 78.59±9.181)5) 85.79±4.272)6)

2.5 各組大鼠前額葉和海馬 BDNF mRNA、CREB mRNA表達量比較

治療21 d后，模型組大鼠前額葉和海馬BDNF mRNA、CREB mRNA表達量顯著低于正常組(P＜0.05);西藥組和電針組前額葉和海馬BDNF mRNA、CREB mRNA表達量較模型組顯著升高(P＜0.05);電針組前額葉BDNF mRNA表達量較正常組、模型組和西藥組顯著升高(P＜0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠前額葉和海馬BDNF mRNA、CREB mRNA表達量比較 (±s)

表5 各組大鼠前額葉和海馬BDNF mRNA、CREB mRNA表達量比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與西藥組比較3)P＜0.05

組別 n 前額葉BDNF mRNA 海馬BDNF mRNA 前額葉CREB mRNA 海馬CREB mRNA正常組 6 0.92±0.192) 1.80±0.192) 1.32±0.202) 1.19±0.142)模型組 6 0.60±0.061) 1.01±0.141) 0.92±0.041) 0.92±0.091)西藥組 6 0.99±0.302) 1.58±0.482) 1.14±0.071)2) 1.15±0.152)電針組 6 1.35±0.221)2)3) 1.72±0.342) 1.15±0.081)2) 1.13±0.162)

2.6 各組大鼠前額葉和海馬BDNF、CREB表達量比較

治療 21 d后，模型組大鼠前額葉和海馬 BDNF、CREB的表達量顯著低于正常組(P＜0.05);西藥組和電針組前額葉CREB和海馬BDNF、CREB的表達量較模型組顯著升高(P＜0.05)，但低于正常組(P＜0.05);電針組前額葉BDNF的表達量較正常組、模型組和西藥組顯著升高(P＜0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠海馬BDNF、CREB表達量比較 (±s)

表6 各組大鼠海馬BDNF、CREB表達量比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與西藥組比較3)P＜0.05;與電針組比較4)P＜0.05

組別 n 前額葉BDNF 海馬BDNF 前額葉CREB 海馬CREB正常組 6 4199.58±400.352)4) 4844.03±546.042) 5885.75±383.992) 5929.13±149.212)模型組 6 2655.03±954.291)3)4) 2820.10±306.861)3)4) 3443.35±438.121)3)4) 2522.75±404.571)3)4)西藥組 6 4697.53±358.782)4) 3710.98±115.551)2) 4584.23±404.831)2) 3412.25±414.781)2)電針組 6 5759.15±762.011)2)3) 3486.55±253.131)2) 4387.90±213.741)2) 3358.67±484.571)2)

3 討論

卒中后抑郁的發生機制與社會心理學、基因多態性、神經遞質紊亂、神經營養因子紊亂、細胞炎性因子等密切相關。其中，神經遞質假說是最為廣泛認可的假說之一，眾多研究發現PSD患者存在5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺合成減少。目前，SSRIs是國內外公認的用于治療 PSD的臨床一線藥物，鹽酸氟西汀作為臨床常用的SSRIs類藥物，能夠選擇性地抑制5-羥色胺轉運體，阻斷突觸前膜對 5-羥色胺的再攝取，使體內5-羥色胺保持較高含量，延長和增加5-羥色胺的作用，從而產生抗抑郁作用，常用于抗抑郁的對照研究中[9]。

近年來發現鹽酸氟西汀在多種神經系統疾病中表現出神經保護作用。Khodanovich M等[22]發現氟西汀能夠抑制腦缺血模型大鼠海馬神經元凋亡，提高新生神經元存活率，改善大鼠神經功能缺損。Dhami KS等[23]發現氟西汀可增加糖氧剝奪模型損傷大鼠的皮質神經元的存活率。Mondal AC等[24]研究發現氟西汀抗抑郁的同時，使PSD大鼠特定腦區下降的BDNF水平回升至正常水平。

神經生長因子BDNF與PSD的關系是近年來研究的熱點。BDNF表達水平降低，BDNF與其特異性受體TrkB介導的MAPK/ERK信號轉導通路活性降低，受損和凋亡的皮層及海馬神經細胞得不到充分的再生補充，導致神經可塑性下降，產生一系列抑郁癥狀[25]。眾多研究者[26]發現BDNF和PSD存在明顯的相關性。如Ifergane G等[21]發現PSD大鼠前額葉及海馬BDNF表達減少，經過抗抑郁治療后，前額葉及海馬BDNF表達增多;Jin HJ等[27]證實氟西汀可以改善 PSD小鼠的抑郁樣行為，并上調海馬BDNF的表達。

BDNF與其特異性的高親和力酪氨酸激酶受體 B(Tyrosine kinase receptor B， TrkB)結合后可誘導其特異位點磷酸化，激活多種蛋白和酶，將 BDNF信號傳遞至細胞核，啟動即早基因和延遲反應基因的轉錄，調節BDNF的表達，為多巴胺能、膽堿能、5-羥色胺能、谷氨酸能等多種神經元提供營養支持，維持正常神經信號的傳遞[28]，發揮保護神經元和促進神經元再生的作用[29]。此外，BDNF可通過調控細胞因子和轉錄因子的表達，控制局部炎癥，在缺血性損傷中起到神經保護作用[11]。CREB是一種重要的轉錄因子，可被多種信號通路激活，能夠調節多種神經系統功能[30]。CREB被MAPK/ERK信號通路激活后，可調節相關基因的轉錄表達，促進BDNF表達增多[31]。

近年來，電針被廣泛應用于PSD的治療中。Li XB等[32]運用Meta分析對電針與抗抑郁藥治療PSD的療效進行了系統評價，發現電針與抗抑郁藥比較雖然療效上無顯著差異，但更安全、可靠、不良反應小。此外，有研究發現針刺可以顯著改善 PSD患者抑郁癥狀，提高患者血清中的BDNF、CREB的表達水平[33-34]。

PSD在中醫學中并未有相對應的病名，多認為其是“中風”與“郁病”的合病。卒中后情志失調，氣機郁滯，痰瘀互結，耗傷氣血津液，使腦神失養，神失所藏導致本病的發生。本研究選取百會、豐隆、太沖、三陰交穴進行針刺治療。百會穴居巔頂正中，為三陽五會之所，具有醒腦開竅、祛風通絡，寧心調神之功;豐隆穴為足陽明胃經絡穴，善于調理脾胃功能，祛痰化濕;太沖為足厥陰肝經原穴，有調和氣血、疏肝理氣、平肝熄風、通經活絡之功;三陰交為肝脾腎三經相交匯之處，可健脾益血、調肝補腎、安神鎮驚。四穴共用，以達到行氣解郁、祛痰化濕、培補肝腎、醒神開竅的功效。電針作為一種治療手段，將現代物理電刺激與傳統的經絡腧穴理論相結合，既可通過低頻電流刺激提高神經肌肉興奮性，又能加強穴位的治療作用，改善氣血運行狀態。

本研究采用線栓法大腦中動脈閉塞模型聯合慢性不可預知溫和應激抑郁癥模型制備PSD模型。在應激21 d后，大鼠神經缺損情況較術后24 h減輕，但仍未恢復，肢體運動功能受損，體質量減輕，自發活動減少，對新環境探索能力減弱，糖水消耗量較少，快感缺失，表現出明顯抑郁癥狀(P＜0.05)，提示PSD模型制備成功。經過21 d的治療，與模型組比較，電針組和西藥組大鼠肢體運動功能明顯恢復，體質量有所增加，自發活動增多，對新環境探索增多，糖水消耗量增加，對獎賞反應敏感(P＜0.05)，提示電針和氟西汀均有效改善了大鼠的抑郁行為，且療效無顯著差異(P＞0.05)。

研究結果顯示，模型組大鼠前額葉及海馬BDNF mRNA、CREB mRNA、BDNF、CREB的表達量較正常組均減少(P＜0.05)，提示 PSD發生后，腦損傷抑制了前額葉及海馬BDNF、CREB表達。電針或氟西汀干預使大鼠前額葉及海馬BDNF mRNA、CREB mRNA、BDNF、CREB表達明顯增多(P＜0.05)。電針較氟西汀能更顯著增加前額葉BDNF mRNA及BDNF表達(P＜0.05)，對其他指標的影響與氟西汀無明顯差異(P＞0.05)。結合大鼠神經缺損評分、體質量及行為學的改變，提示電針能夠顯著改善PSD大鼠抑郁行為，其抗PSD機制可能通過增加大鼠前額葉及海馬BDNF、CREB的表達來實現。