生物熱化學和熱動力學研究進展

謝文，周蓮嬌，徐娟，郭清蓮，蔣風雷，劉義,＊

1武漢大學中南醫院檢驗科，武漢 430071

2武漢大學化學與分子科學學院，武漢 430072

1 引言

生命相關過程伴隨著極其復雜的化學和物理過程，包含著物質變化和能量轉換。隨著傳統熱力學框架的完善，熱化學測量技術的快速發展以及學科交叉滲透發展，熱化學技術和方法在生命科學領域的應用越來越顯示出其迫切性和優越性。

與化學過程相比，生物工藝過程忽視了生物過程中的熱力學規則，忽略了復雜生物分子和細胞代謝的熱力學中的一些特定規律1。而隨著生物工藝的發展，人們可以更實時、定量地描述生物分子的構-效關系，可采用模擬和建模方法降低實驗成本2，熱力學推導的模型3-7在這方面做出了非常顯著的貢獻。然而，傳統的熱力學處理方法對具有極其復雜結構和電荷分布的生物分子的行為描述不夠精確，同時全細胞生物催化過程的熱力學處理，也對傳統熱力學提出了很高的要求。細胞新陳代謝過程通常發生在遠離平衡態的狀態下，并且還具有高度不可逆性和自組織性，而復雜的反應環境、強烈的相互作用以及活細胞或細胞器內大量小分子的存在，都使這一過程更加復雜。

我們可以將生命體系看作復雜而開放的熱力學系統，所有生物生長代謝過程都伴隨著物質和能量交換。生物體在新陳代謝過程中部分能量以熱的形式散發出來，即產生代謝熱，這是生物熱化學發展的基礎。生物代謝產熱過程一般有強度低、周期長、速率慢的特點，利用高精度、自動化和連續式的微量熱儀，可對其進行連續跟蹤監測，獲取相關過程熱力學和動力學信息。量熱計是用于熱量測定的儀器。量熱計在量熱計腔與量熱計恒溫塊之間設置大量的熱電偶。測量池中的樣品由于某反應的進行而產生熱效應，使得其本身的溫度發生改變。此時樣品和恒溫塊之間存在一定的溫差(ΔT)，高靈敏度的熱電偶將量熱計腔與恒溫塊之間的溫度差轉換為電信號，經放大后輸出。量熱計連續地、無損地檢測化學或生物過程所產生的熱量，并繪制熱功率P隨時間t變化的精確曲線，即為熱譜圖。熱譜圖包含了反應過程的熱力學和動力學信息。

量熱計可分為間接量熱計和直接量熱計。間接量熱計通過體系中O2的消耗量及CO2的產量或者某種已知熱容物質的溫度變化來推算待測體系的熱效應。間接量熱計的對象是開放系統，因此適用于需要氣體交換的生物個體生長代謝的能量代謝測定。直接量熱計通過測定體系熱流變化從而實現實時監測反應過程的熱效應。靈敏度很高的直接量熱計適用于研究生物生理過程的代謝熱、生物大分子的熱動力學性質、生物大分子與小分子或者生物大分子之間相互作用的熱效應。

高度靈敏的微量熱法如差示掃描量熱法(DSC)、恒溫滴定量熱法(ITC)和熱活性微量熱法(TAM)等，可用于研究簡單分子相互作用和理解構效關系，也用于理解和預測生物系統的復雜非線性行為。量熱法以各種運動形式產生的熱效應為研究對象8，揭示能量變化規律和定量能量轉化。量熱方法中，由熱信號提供生物過程的動力學及化學計量學相關的實時信息，可有效獲取化學反應和生命相關過程的焓變(ΔH)、熵變(ΔS)、吉布斯自由能變化(ΔG)、平衡常數(K)和結合計量數(n)等系列熱力學參數，這些參數可以體現單個物質的熱力學特性，也能反映化學反應中相關分子的結構、性質及其作用機制9。

量熱學在生命科學領域中的應用十分廣泛，可以用來描述生態系統、生物進化等宏觀過程，也可以觀測個體和細胞生長、線粒體代謝狀況，還可以研究酶促反應、小分子與生物大分子相互作用等分子水平的生命科學微觀問題。

2 量熱法在生態學中的應用

全球變暖引發了一系列生態問題，全球碳循環中最大的通量之一，是土壤有機質降解從土壤表面排放二氧化碳。土壤微生物代謝活性是評價土壤質量的普適指標10，土壤中生物的生長代謝、物質的理化過程往往伴隨著熱量釋放。熱量釋放通常是一種非選擇性信號，應用等溫微量熱技術，非特異性地監測和記錄土壤微生物代謝特征，極大地推動了復雜土壤體系微生物代謝研究。

為了更系統地監測土壤微生物動態，為早期預警提供實驗方法和數據，Hansen等11通過量熱儀模擬極端熱浪，研究了溫度對不同土壤類型的有機質分解速率的影響，如圖 1顯示了兩種土壤樣品的平均熱速率、酶催化氧化速率和直接氧化速率隨溫度的變化。有機質直接氧化和酶催化氧化兩類反應在正常環境溫度下同時存在，一起組成土壤有機質礦化過程，而其對土壤有機質礦化速率的相對貢獻隨溫度、土壤類型等因素的變化而變化。

圖1 兩種土壤樣品平均熱速率(紅線)、直接氧化速率(藍線)和酶催化氧化速率(綠線)隨溫度變化趨勢11Fig. 1 An easily recognizable change of the averaged heat rates (red lines), direct oxidation rates (blue lines) and enzyme catalyzed oxidation rates (green lines) increasing trend with temperature in two samples 11.

Barros等12用熱呼吸法，測定了經4 °C下儲存后的土壤樣品對土壤中微生物代謝的變化，得到了微生物代謝的產熱速率和二氧化碳產生速率。結果表明土壤有機質越不穩定，土壤中的微生物代謝多樣性越高，說明微生物代謝降解碳水化合物的能力強，且對貯藏條件更敏感。這為實驗中土壤樣品的合理保存提供指導。Barros等13用熱分析方法，結合核磁共振法，研究了六種不同碳含量樣品的熱性質、其土壤有機質的結構和組成。證明可以利用差示掃描量熱法(DSC)和熱重法(TG)快速準確檢測土壤總碳含量，推測土壤總能量含量。

Xu等14通過土壤熱力學參數，研究不同微生物對不同碳基質的代謝能力差異，證明了細菌和真菌是土壤有機質最重要的分解者，且用微量熱法可以量化土壤微生物對碳的利用效率。Karina與其合作者15,16評價改良土壤中的酶活性，研究熱效應與纖維素酶、蛋白酶和尿素酶活性的關系，結果顯示牛糞、城市污水污泥、蚯蚓糞來源的酶活性依次降低。證明了微量熱法是分析土壤中微生物和酶活性的有力工具，可以幫助更好地了解土壤微生物代謝的動態。

Anne等17利用微量熱法，監測了來自酵母廢水處理廠的硫酸鹽還原菌(SRB)的厭氧消化過程，并測量SRB的生長速率。Nabil等18測定以乙醇為溶劑的低壓(LP)萃取和以二氧化碳和乙醇為共溶劑的亞臨界流體(SF)萃取所得的廢咖啡提取物的抗氧化活性差異，表明LP提取物具有比SF提取物更高的抗氧化能力。兩種提取物抗氧化活性結果都表明廢咖啡顯示出作為抗氧化劑的巨大潛力，研究結果可為生態系統管理維護提供依據，證明量熱法具有作為通用抗氧化劑和促氧化劑活性分析的能力。

3 量熱法在組織和器官研究中的應用

量熱法在組織和器官研究中的應用，主要指對離體動植物組織和器官的量熱學研究。Kamrul等19應用恒溫微量熱法，檢測到分別經抗壞血酸溶液、脈沖光和紫外-可見光處理后，鮮切蘋果的產熱量急劇下降。微量熱數據與其他技術所得結果(乙烯產生量、酸堿度、顏色、質地、味道)的結合，可以幫助比較食品工業中不同處理對新鮮水果的影響。Kamrul等20基于抗氧化劑和漿果提取物與過氧化氫反應過程中的產熱，在恒溫條件下(25 °C)測定其清除自由基的活性。量熱法能直接、同時提供抗氧化劑或天然提取物清除自由基反應的熱力學和動力學性質，即過氧化氫反應的焓(ΔH)和速率常數(k)等。Haman等21提出了一種基于AIBN(2,2’-偶氮雙(2-甲基丙腈))與親脂性抗氧化劑反應過程中產熱的測定氧化應激的方法。在沒有抗氧化劑時，AIBN產生放熱峰；在抗氧化劑的存在下，這種峰值會延遲。根據延遲的程度，對樣品自由基清除活性可以進行簡單而直接的估計。采用等溫量熱法，通過與AIBN的反應，測定合成抗氧化劑和天然親油性抗氧化劑(五種特級初榨橄欖油樣品)的自由基清除活性。各抗氧劑的量熱結果與DPPH測定結果呈正相關，特級初榨橄欖油的量熱結果與總酚含量呈正相關。

Ksenia等22采用等溫微量熱法，對葡萄經釀酒酵母接種后的發酵能力進行了分析，葡萄栽培期間使用草甘膦除草，降低了葡萄的酵母生長速度，而尿素施肥可增強酵母生長能力。Rakhmatullina等23研究了一氧化氮(NO)對小麥幼苗耗氧量、產熱及細胞超微結構的影響。用微量熱計，通過電子順磁共振(EPR)、呼吸法(氣體計量法)、產熱法測定NO。結果表明NO的生成伴隨著小麥幼苗呼吸頻率下降約30%，持續了5-6 h。說明植物組織的過量NO會導致能量交換的減速、超微結構的紊亂和細胞死亡。

4 量熱法在細胞水平上的研究

對動物細胞和微生物細胞的量熱學研究，可以說是量熱學在生命科學研究的主要領域。微量熱法在微生物研究工作中的應用主要包括細菌分類鑒定、細菌生長代謝及其規律、藥物對微生物生長的抑制作用、結合動力學原理，研究微生物生長代謝熱動力學特征等24。大量實驗證明，微量熱在無干擾地監測微生物的正常活動和固有代謝過程、定量描述微生物生長代謝過程、藥物和毒物對微生物生長代謝影響等方面的作用顯著。

根據細菌生長熱譜曲線以及得到的熱動力學參數，郜丹等25以微生物生長速率大于零及熱功率差值大于三倍基線噪音為評價標準，以7種常見微生物為對象，測定了各菌株單獨和混合培養的生長熱譜曲線和檢出時間。較常規方法，生物熱動力學有實時、快速、靈敏度高、適用性好的優點。Winkelmann等26應用量熱計對不溶于水的碳源(正十四烷和正十六烷)對乳白色葡萄球菌的生長影響進行了研究，建立了微生物生長過程熱動力學方程。實踐證明，量熱法適用于研究多相體系中的微生物代謝過程。Russel等27設計了一種新型的LED照明的恒溫微量熱法，將微藻的熱力學行為記錄為功率-時間曲線，得出微藻的總熱效應、最大輸出功率和每個藻細胞產熱等指標，來更好地了解藻類的二氧化碳固定性能和生長過程中的熱力學行為。

噬菌體大量存在于自然環境中，可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。溫和噬菌體侵染細菌后，噬菌體的基因組能夠整合入宿主染色體，整合后的細菌稱為溶源性細菌。溶源性細菌在正常環境中可穩定生長繁殖，并且對同類噬菌體及其近緣噬菌體的侵染具有免疫性。但任何可以引起基因突變的物理、化學因素，都可能誘導沉默的原噬菌體激活繁殖28。利用細菌與未感染細菌之間的代謝熱差異，Xu等29發現在恒溫微量熱實驗中，溶源細菌與非溶源細菌混合體系對化學試劑的誘導效應高度敏感，可用于化學試劑對原噬菌體誘導活性的快速檢測。該方法工作負載低、需要誘導藥物極少，且可實時監測預防激活效果、適用于自動化和高通量測量。以該快速檢測方法為基礎，Xu等30研究了CdTe量子點的原噬菌體誘導活性，圖2的量熱結果發現分別經巰基丙酸(MPA)和谷胱甘肽(GSH)表面修飾的 MPA-CdTe和 GSH-CdTe量子點均能激活原噬菌體，而且MPA-CdTe量子點的誘導活性強于 GSH-CdTe量子點。結合細菌內活性氧含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質過氧化水平檢測結果，發現CdTe量子點引起的氧化應激是導致原噬菌體誘導的重要原因。在研究宿主細胞與噬菌體相互作用上，微量熱學方法可以更快速地得到更多豐富的熱動力學信息。劉國生等31-33采用微量熱學方法對噬菌體侵染大腸桿菌進行了研究，通過對熱譜曲線數據分析，可以得到噬菌體-大腸桿菌系統變化的熱動力學方程、細胞生長抑制熱動力學方程、宿主細胞裂解熱動力學方程等。這些熱力學信息用于研究噬菌體與宿主之間的相互作用，結果表明微量熱技術對這樣的復雜系統進行研究有著獨特的優越性。在T4噬菌體增殖過程微量熱研究中，得到了停流法在 37 °C測定的不同感染復數下E. coliB的熱功率曲線(如圖3)。將熱譜曲線的三個主要峰標記為峰 I、峰 II和峰III。在感染復數(Multiplicity of Infection，MOI)為2.8 × 10?4時，熱譜曲線2幾乎與對照組曲線1重合，說明加入的噬菌體樣品因為多次稀釋與加樣隨機誤差，樣品中的T4噬菌體幾乎為0；曲線3上的峰 I為典型的對數生長峰，可以看成大腸桿菌的有氧呼吸產熱峰，同時峰II為肩峰，可看成厭氧生長產熱峰，峰III為緩慢產熱峰；曲線4、5的峰II也是緩慢產熱峰；MOI為2.8和28的曲線6、7在一個產熱峰后基線幾乎回到零點，說明E.coliB幾乎被完全裂解。通過對熱譜曲線數據分析可以得到豐富的熱力學信息，反映 T4噬菌體與宿主細胞相互作用的關系。細胞靜息培養是指在最低限度培養基中研究細胞生理活性的一種方法，此時細胞不能進行生長和繁殖，可避免細胞生長產生的大量熱量干擾，劉國生等32用停流法研究了靜息培養下 T4噬菌體感染大腸桿菌細胞過程中兩者的相互作用，計算得到單個細胞的發熱功率和發熱量，說明感染狀態下細菌細胞代謝速率加快，但繁殖速率明顯下降。

圖2 不同濃度量子點對大腸桿菌生長代謝產熱的影響30 Fig. 2 Dependency of the metabolic heat production rate of E. coli on the dosage of MPA-CdTe and GSH-CdTe QDs 30.

圖3 T4噬菌體與大腸桿菌生長的功率-時間曲線31Fig. 3 Power-time curve recorded from the growth of E. coli B and T4 phages in LBG medium 31.

目前主要通過視覺檢查(VI)來評估注射藥物溶液的無菌性，Brueckner等34提出用熱流分析代替視覺生長檢測。他們評估了恒溫微量熱測定法(IMC)作為無菌控制的VI的替代品的可能性，發現IMC可以檢測到所有接種樣品中的微生物生長，并且在92%的樣品中檢測到微生物生長的速度明顯快于VI。IMC的可靠性和靈敏度對提高無菌控制有很大的潛力。

以微生物和人工培養的動物細胞為模型，研究藥物分子的藥理和毒性作用，也是目前比較活躍的研究領域。結合微量熱方法，定量研究藥物對細胞模型生長代謝過程影響，可為發現和篩選有效抗癌藥物、探究藥物作用機理和探索最佳用藥配比，提供可靠的數據和指導。用含銀傷口敷料治療，已成為在愈合過程中消除機會性傷口病原體生長的普遍策略。考慮到銀的成本及其可能產生的副作用，人們在確保銀在傷口環境中達到最低殺菌濃度(MBC)的同時，希望傷口敷料中含有盡量少的銀活性成分。Gaisford等35報導了一種采用熱活性微量熱法(TAM)測定傷口敷料中銀功效的定量方法，測得銀對銅綠假單胞菌的MBC為1 ×10?4mol·L?1。采用該方法，Jawal等36測定了含銀敷料對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌兩種常見傷口病原體的療效。實驗在營養肉湯培養基和模擬傷口液中進行。模擬傷口液且厭氧條件下銀的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度較高。結果表明了藥品在生物相關介質中試驗和進行體外分析的重要性，也說明該方法在生物體和生長介質改變時也能很好的應用。

恒溫微量熱法已被廣泛應用于評價抗生素對細菌和真菌生物膜嵌壁細胞的殺菌活性37,38。細菌生物膜對傳統的抗菌治療有很高的抵抗力，最近烈性噬菌體被重新評估為在生物膜中也能殺死抗生素抗性細菌的有效藥劑。Tkhilaishvili等39使用等溫微量量熱法評估T3噬菌體與浮游和生物膜大腸桿菌TG1的相互作用。將T3與大腸桿菌TG1一起孵育，在較低的噬菌體濃度(103PFU·mL?1)下，對浮游和生物膜中的產熱都有很強的抑制作用。

5 量熱法在亞細胞水平上的應用

亞細胞水平上的微量熱研究，主要集中在線粒體和細胞膜/模擬細胞膜上。為了改進生物分子相互作用研究，有必要建立熱力學模型部分替代昂貴且精細的實驗。

微量熱法在生物膜的研究中具有很大的潛力，由飽和脂質和不飽和脂質組成的二元脂質混合物，是細胞膜的重要模型。Wu等40研究了飽和和不飽和磷脂二元混合物分子水平的相變圖。利用氘化二鋁酰磷脂酰膽堿(DPPC-d(62))和氫化二元醇磷脂酸(DOPA)，差示掃描量熱法分別分析兩種脂質組分的熱致相變過程，實驗中觀察到單一吸熱峰。結合傅立葉變換紅外光譜，表明兩種脂質在熱致相變后的尾部區域有非同步構象重排。給出了由飽和脂肪和不飽和脂肪組成的二元脂質混合物中單組分脂質的熱致相變速率，該方法可以擴展到揭示各種其他脂質混合物(如脂質筏)或表面活性劑混合物中相轉變過程的分子機制。Wu等41用微量熱法和圓二色譜法，研究了溶菌酶分子在雙親水性嵌段共聚物，甲氧基聚乙二醇5K嵌段聚天冬氨酸鈉鹽 10(MPEG5K-B-PLD10)存在下的展開和再折疊行為。結果表明，天然溶菌酶在加熱和冷卻時呈現可逆的展開和再折疊，而處于新折疊狀態(與聚合物帶相反電荷的 PLD段復合)的溶菌酶因為失去部分三級結構且二級結構發生改變，熱穩定性降低，在加熱時可以展開，但是在隨后冷卻時不能再折疊。由于生物膜難以在密閉安瓿中生長和維持，其應用往往局限于監測已建立的生物膜的活性。

圖4 流動量熱計的示意圖42Fig. 4 Schematic representation of the flow calorimeter 42.

Jawal等42使用流動系統從外部連續供應營養素的方法，允許生物膜在安瓿內形成，從而實現直接實時監測能量變化。實驗觀測到金黃色葡萄球菌處于生物膜內時，對抗菌劑的抗性增強，同時證明該流動系統可用于在醫用級塑料上建立和監測生物膜的形成和生長。設計的流動量熱計的簡單系統(如圖 4)主要包括外部生物反應器、TAM 量熱儀和廢水箱。生物反應器通過夾套水浴保持在37 °C，其中的介質通過硅膠管進入TAM系統。在TAM中，待測介質先經過熱交換線圈以保持與量熱計內溫度一致，接著進入與安瓿瓶入口連接的不銹鋼管，不銹鋼管在充滿傳熱介質的安瓿瓶中盤繞后與安瓿瓶出口相連。蠕動泵安裝在流出管中，維持介質循環速度為4 mL·h?1。Sanatan等43用等溫滴定量熱法研究了油酸對腎上腺素誘導的大鼠心臟線粒體損傷的保護作用。與腎上腺素體外孵育后，線粒體膜的脂質過氧化和蛋白質羰基化水平升高，谷胱甘肽含量降低，線粒體形態、膜電位和完整性改變。當線粒體在體外與腎上腺素和油酸共孵育時，所有這些變化得到明顯改善，結合早期研究說明油酸可以是一種有效的心臟保護抗氧化劑。Dong等44研究了牛血清白蛋白(BSA)包覆的超小銀納米團簇(NCS)對離體大鼠肝線粒體的生物學效應。闡明Ag-BSA-NCS通過兩種不同方式的協同作用誘導線粒體功能障礙：(1)通過與線粒體膜磷脂雙層相互作用，誘導線粒體膜通透性轉變(MPT)；(2)通過產生活性氧(ROS)，造成線粒體呼吸損傷。首次提出并闡述了超小尺寸納米顆粒(約2 nm)在亞細胞水平的生物學效應。

Zhao等45采用微量熱法，分析了Gd3+對體外線粒體的影響。Yang等46研究了聚羥基富勒烯C60(OH)44對分離線粒體的影響。Lai等47研究了不同粒徑的GSH-CdTe量子點對線粒體的毒性作用，同時證明量子點與蛋白質的結合親和力高于磷脂。Shore等48將熱力學分析與分子模型和結構測定相結合，研究了一種基于尿素的親環素小分子對線粒體的保護作用。袁蓮等49-54使用熱活性檢測儀(TAM)和等溫滴定量熱儀(ITC)，研究了經一系列藥物(呼吸抑制劑、有機砷、Ca2+、In3+、Ag+、Gd3+等)作用后，離體線粒體的實時產熱功率、總產熱量、新陳代謝速率常數等熱力學參數，同時獲得線粒體代謝加快或減慢、活性增加或減小等信息。

6 分子水平的量熱學研究

生物大分子包括核酸、蛋白質、生物多糖和脂質，是構成生命的基礎。生物大分子的空間構象、熱力學穩定性等，與其生物活性和生物學功能直接相關。量熱法很好的用于生物大分子結構與功能關系的熱分析研究。Frank等55以比較的方法來確定紅球菌和混合細菌培養物使用表面活性劑作為唯一碳源和能源的能力。這些表面活性劑包括鼠李糖醇、槐糖脂和海藻糖四酯及Tween 80。量熱法、熱力學計算、質譜、高效液相色譜以及生物量測定的結果說明，純培養物的紅球菌只能夠利用表面活性劑Tween 80；混合細菌培養物能夠使用所有選定的表面活性劑作為唯一的碳和能源，但只有鼠李糖脂被完全降解，其他表面活性劑僅發生了初級降解。其中每摩爾碳的焓變作為評估降解程度的重要參數，說明量熱法是識別復雜分子降解途徑中特征的有力工具。Goldber等56報道了四種纖維素同素異形體(非晶態纖維素、纖維素I、纖維素II和纖維素III)在25 °C下水解為結晶無水α-D-葡萄糖的熱動力學數據，以及四種同素異形體從2 K到300 K的熱容量。Marko等57報道了纖維素水解的熱力學數據以及平衡葡萄糖濃度，測定了葡萄糖水溶液的活度系數與溫度的函數。隨著溫度的升高，反應ΔG變得更負，這表明在更高溫度下生產纖維素生物燃料會有更高的轉化率。同時，全球變暖會加速纖維素被土壤微生物降解為二氧化碳和水的過程，通過正反饋加速全球變暖。Liu等58采用過氧化氫預處理及胃蛋白酶水解的方法，提取蛇頭皮中的胃蛋白酶可溶性膠原蛋白，并經氨基酸分析、紫外光譜和差示掃描量熱法證實了膠原蛋白較高的純度和熱穩定性。

Marco等59報道了一種能表征固定化酶活性和穩定性的量熱法。以固定在尼龍-6納米纖維膜上的轉化酶為研究對象，采用分光光度法和恒溫滴定量熱法，測定了固定化和游離轉化酶活性和穩定性；采用差示掃描量熱法，測定了膜上轉化酶結構的熱穩定性和表面濃度，證明ITC可用于測定固定在膜上的酶的活性和穩定性。Neha等60通過量熱，測定了在不同溫度下NaH2PO4、NH4H2PO4和K3PO4水溶液中各種糖及其衍生物的熱變化。Gennady等61對纖維素、淀粉和葡萄糖形成左旋葡萄糖的平衡進行了熱力學分析。用絕熱量熱法，測定了在5-370 K左旋葡聚糖的熱容量。用差示掃描量熱法，測定了該化合物的固相轉變和熔融的溫度和焓。從得到的結果計算出在0-384 K左旋葡聚糖晶體的熱力學性質。Wu等62采用加熱-冷卻-再加熱方案，研究了溶菌酶在負電荷聚電解質-聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)存在下的展開和再折疊行為。納瓦差示掃描量熱(nano DSC)和CD光譜法結果表明，溶菌酶與PSS的絡合作用能顯著改變溶菌酶的折疊和復性行為。這種加熱-冷卻-再加熱的過程，可以提供有關聚電解質復合蛋白的結構和性質的線索，該方法也可用于研究目標蛋白在其他含蛋白質混合物中的展開和重折疊細節。

微量熱法同時適合用于生物大分子與其他小分子相互作用的熱力學研究。Catherine等63研究了鋁、鎳和鎘三種典型金屬離子與DNA的作用及其核酸毒性，等溫滴定法結果表明Al3+、Cd2+、Ni2+可強烈結合DNA的磷酸基團，生理條件下Cd2+、Ni2+具有遺傳毒性。而隨pH升高，金屬鋁的主要離子種類由Al3+變為[Al(OH)4]?，不再能與DNA強烈結合。實驗結果強調了細胞內的pH范圍變化的作用。

Burova等64采用比濁法、高靈敏度差示掃描量熱法和等溫滴定量熱法，研究了可生物降解陰離子聚磷腈(PCPP)與蛋清溶菌酶模型球蛋白的相互作用，得到了相應的結合常數、協同性參數和結合焓。Escoba等65用差示掃描量熱法，研究了新的潛在抗癌藥物與二巰基磷膽堿(DMPC)脂質體的相互作用。Boros等66用差示掃描量熱法、圓二色譜和核磁共振光譜以及分子動力學模擬，研究了絲氨酸蛋白酶抑制劑的穩定性、分子結構和動力學。Krauss等67采用等溫滴定量熱法，測量了小鼠抗c-myc抗體與其表位肽的相互作用，得到典型的焓-熵補償數據。

冷凍條件會影響魚類肌肉蛋白質功能，引起蛋白質的變性和聚集。然而，洪堡魷魚(Dosidicus gigas)肌肉蛋白的功能在冷凍后仍保持穩定，這可能是由于存在作為低溫保護劑的低分子量化合物(LMMC)。álvarez-Armenta等68利用傅立葉變換紅外光譜法，測定LMMC的主要成分為游離氨基酸(精氨酸、肌氨酸和牛磺酸等)、碳水化合物(單糖葡萄糖、巖藻糖、阿拉伯糖等)、氯化銨等，同時通過差示掃描量熱法，驗證了LMMC可賦予蛋白質低溫穩定性。

Wu等69在研究多肽Gly-Asn-Gly-Ser-Gly-Tyr-Val-Ser-Arg對血管緊張素轉化酶(ACE)的抑制機制時，采用等溫滴定量熱法測定肽與ACE結合反應的熱力學特征，結果暗示多肽在反應過程中分解并起到了底物型抑制劑的作用。

Yang等70應用各種光譜測量技術和等溫滴定量熱法(ITC)，研究了富勒烯與牛血清白蛋白(BSA)和γ-球蛋白之間的相互作用。ITC結果表明，富勒烯與BSA之間的相互作用是放熱過程(ΔH＜0)，與γ-球蛋白的相互作用是吸熱過程(ΔH＞ 0)。結合多種分析技術結果，提出了蛋白質在納米顆粒上的絡合涉及兩個同時發生的過程，即非共價鍵形成(ΔH＜ 0, ΔS＜ 0)和溶劑重組(ΔH＞ 0, ΔS＞0)。Zhang等71通過ITC和其他光譜技術，研究了抗壞血酸(ASA)與人血清白蛋白(HSA)的相互作用，并通過ITC判斷小分子與蛋白的結合位點。

7 結語

從內在生物過程(生長發育、厭氧消化、兩相生物催化、蛋白質相互作用、核酸穩定性)、過程分析(芯片量熱法和生物傳感器)，到下游加工(生物分離)和環境過程(廢水回收以及土壤微生物檢測)等，生物量熱的應用范圍十分廣泛，而且正在迅速地增加。隨著微量熱儀在測溫精度、控溫穩定性、自動化和多功能化發展等方面的巨大發展和進步，微量熱技術在未來的生命科學領域必將扮演更重要的角色。同時，由于生物量熱法自身缺乏特異性，無法直接獲得分子層面信息等局限，相信在未來會有越來越多的量熱法與多種分析技術結合的、多領域應用(尤其生物學、醫學、藥學中應用)的研究成果。