活血通絡利水方含藥血清在高濃度谷氨酸環境下對Müller細胞谷氨酸-天冬氨酸轉運體、谷氨酰胺合成酶蛋白表達及活性的影響※

賈 鑫 蘇學敏 張 越 袁立飛 楊贊章 張銘連

(河北省眼科醫院河北省眼科學重點實驗室，河北 邢臺 054001)

活血通絡利水方為河北省首屆名中醫張銘連教授基于絡病理論和長期臨床實踐創立的一首活血通絡名方，具有活血通絡、祛瘀解毒的功效，用于治療各種原因導致的目絡瘀阻而造成的缺血性眼病，并獲國家發明專利[1]。活血通絡利水方在眼科臨床應用20余年，治療缺血性眼病已取得確切臨床療效，能夠提高患者視力，改善視野[2-3]，并改善患者血脂水平和血液流變學指標[4]。缺血性眼病視力損傷的發生機制復雜，重要原因之一為視網膜微環境中高濃度的谷氨酸(GLU)對視網膜神經節細胞(RGC)的興奮性神經毒性損傷[5-6]。Müller細胞作為視網膜內主要的神經膠質細胞，通過GLU-天冬氨酸轉運體(GLAST)和谷氨酰胺合成酶(GS)維持視網膜正常的GLU代謝，以支持并保護視網膜各級神經元[7]。為進一步探討活血通絡利水方的作用機制，我們采用高濃度GLU損傷Müller細胞，觀察活血通絡利水方含藥血清對細胞GLAST、GS蛋白表達及活性的影響，以期為中藥復方治療缺血性眼病提供更多的理論依據和防治思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞 SD大鼠(雄性)40只，周齡6～8周，體質量(180±20)g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK[湘]2014—0011。SD大鼠Müller細胞，由上海哈靈生物科技有限公司提供(批號：HL-C643)。

1.1.2 藥物 活血通絡利水方藥物組成：黃芪30 g，當歸尾15 g，赤芍12 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭6 g，丹參12 g，葛根30 g，絲瓜絡10 g，郁金10 g，石菖蒲10 g，澤蘭10 g，茺蔚子15 g，金銀花30 g。由河北省眼科醫院中藥房、制劑科提供。經水煎，濃縮為含生藥2 g/mL和4 g/mL的合劑。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養箱、-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)；4 ℃冰箱(中國海爾集團)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；TGL-16gR高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；電熱恒溫水槽(上海一恒科學儀器有限公司)；小型垂直電泳槽、小型轉印電泳槽(美國Bio-Red公司)；高效液相色譜儀(日本島津公司)；TS-2型脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.4 試劑 0.9%氯化鈉注射液(中國石藥銀湖制藥有限公司，國藥準字H14020821，批號：41218093009)；銀杏葉片(揚子江藥業集團有限公司，國藥準字Z20027949，批號：18070621)；GLAST抗體(批號：ab416)，GS抗體(批號：ab73593)，β-actin抗體(批號：ab8227)，GLU(批號：G8415)，以上試劑均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(批號：BA1054)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)制備試劑盒(批號：P1200)，免疫化學發光法(ECL)試劑盒(批號：AR1170)，以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白裂解液(批號：C900226-0050)，蛋白印跡膜再生液(批號：C500031)，0.22 μm濾膜(批號：F502522)，以上試劑均購自生工生物工程上海股份有限公司；噻唑藍(MTT)(批號：M8180)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：PC0020)，二甲基亞砜(批號：D8371)，脫脂奶粉(批號：D8340)，TBST緩沖液(批號：T1081),以上試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；色譜級甲醇(批號：M20003)，購自北京謹明生物科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號：ISEQ00010)，購自美國Merck Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 活血通絡利水方含藥血清制備 將40只健康SD大鼠(雄性)按照隨機數字表法分為4組，即正常組、銀杏葉組、活血通絡利水方低劑量組和活血通絡利水方高劑量組，每組10只。活血通絡利水方低、高劑量組分別予濃度2、4 g/mL的活血通絡利水合劑10 mL/kg(20 g/kg、40 g/kg)灌胃，銀杏葉組予銀杏葉片水溶劑5.2 mg/kg灌胃，正常組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，連續灌胃7 d。灌胃期間大鼠自由攝取食水。末次給藥1 h后，腹主動脈取血，3 500 r/min離心10 min收集血清，滅活，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率 Müller細胞以1×105個/mL密度接種于96孔板，每孔加入100 μL DMEM培養基，靜置于5%CO2、37 ℃ 培養箱培養。待細胞貼壁后棄去培養基，分別加入含0、0.1、0.5、1、10、20、25、30 mmol/L GLU濃度的培養基處理24 h，各濃度處理組設立5個復孔，之后各孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續孵育4 h。棄去上清液，各孔加入150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩15 min溶解結晶物。應用酶標儀于波長570 nm處測量各孔的吸光度值。計算各組吸光度均值，各組均值/0 mmol/L GLU均值為各組細胞存活率。

1.2.3 Western Blot檢測GLAST、GS蛋白表達 Müller細胞設為5組，即正常組、模型組、銀杏葉組、活血通絡利水方低劑量組及活血通絡利水方高劑量組，各組設立8個復瓶。細胞以 2×106個/mL 密度接種于 T25 培養瓶，每瓶加入 2 mL DMEM培養基，靜置于5%CO2、37 ℃ 培養箱培養。待細胞融合至80%時，正常組、模型組每瓶加入正常血清0.5 mL、培養基2 mL，銀杏葉組每瓶加入銀杏葉5.2 mg/kg含藥血清0.5 mL、培養基2 mL，活血通絡利水方低、高劑量組每瓶分別加入活血通絡利水方20、40 g/kg含藥血清0.5 mL、培養基2 mL。除正常組外，其余4組均加入GLU 25 mmol/L。各組置于培養箱中繼續培養24 h后，棄去培養液，加入裂解液充分裂解細胞成勻漿，4 ℃條件下13 300 r/min離心15 min，收集上清蛋白液，即為總蛋白提取物。BCA法測定蛋白濃度，每孔25 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，分別孵育GLAST、GS抗體(1∶1 000)4 ℃反應過夜，孵育二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫反應1 h，采用ECL試劑盒顯影蛋白質。同一張膜使用TBST溶液清洗，加入蛋白印跡膜再生液，室溫震蕩30 min，TBST溶液清洗，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，之后孵育內參β-actin抗體(1∶5 000)，孵育二抗，顯影。掃描圖像并應用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值為半定量蛋白表達結果。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)法檢測GLU含量 Müller細胞設為4組，即模型組、銀杏葉組、活血通絡利水方低劑量組和活血通絡利水方高劑量組，各組設立8個復孔。細胞以 5×105個/mL 密度接種于6孔板，每孔加入2 mL DMEM培養基，靜置于5% CO2、37℃培養箱培養。待細胞融合至80%時，模型組每孔加入大鼠正常血清0.5 mL、培養基2 mL，銀杏葉組每孔加入銀杏葉5.2 mg/kg含藥血清0.5 mL、培養基2 mL，活血通絡利水方低、高劑量組每孔分別加入活血通絡利水方20、40 g/kg含藥血清0.5 mL、培養基2 mL，各組均加入GLU 25 mmol/L。各組置于培養箱中繼續培養24 h后收集細胞上清液，用色譜級甲醇沉淀蛋白，過濾待測。采用HPLC法測定GLU濃度，色譜柱為大連依利特分析儀器有限公司SinoChrom-BP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈：磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L，pH 6.0)，16∶84(V/V)，流速為1 mL/min，檢測波長為472 nm，柱溫20 ℃，進樣容積20 μL。將 10 mmol/L GLU 標準品溶液用超純水稀釋成 12.5、25、50、100、250、500、1 000、2 500 μmol/L對照品溶液，設置正常培養液為陰性對照，各對照品溶液和待測樣品按前述色譜條件進樣，經 HPLC-紫外光譜(UV)檢測后得到各組色譜峰面積值。以各對照品組的GLU濃度為橫坐標，譜峰面積值為縱坐標，進行線性回歸，得到濃度-色譜峰面積值相關的標準曲線方程，再根據各樣品組的色譜峰面積值計算得出各樣品組的 GLU 濃度。

2 結 果

2.1 不同濃度GLU對Müller細胞存活率的影響 見表1。

由表1可見，GLU(0、0.1、0.5、1、10、20、25、30 mmol/L)處理24 h后，與0 mmol/L GLU濃度比較，0.1、0.5、1、10 mmol/L GLU濃度下Müller細胞存活率升高(P<0.05)，20、25、30 mmol/L GLU濃度下Müller細胞存活率逐漸降低(P<0.05)。結果表明，10 mmol/L及以下低濃度GLU促進Müller細胞活性；20、25、30 mmol/L GLU抑制Müller細胞活性，造成細胞損傷，抑制作用隨GLU濃度的升高而增強。GLU濃度為25 mmol/L時，Müller細胞存活率與0 mmol/L濃度下細胞存活率相比約為0.67，說明該濃度GLU可以引起細胞毒性損傷并且大部分細胞尚存活，因此后續實驗選擇25 mmol/L GLU干預Müller細胞以建立GLU損傷細胞模型。

GLU濃度(mmol/L)n24 h存活率051.00±0.030.151.57±0.02?0.551.47±0.05?151.30±0.05?1051.08±0.03?2050.88±0.03?2550.67±0.02?3050.35±0.03?

與0 mmol/L GLU濃度比較，*P<0.05

2.2 各組含藥血清在高濃度GLU環境下對Müller細胞GLAST、GS蛋白表達的影響 見表2、圖1。

組 別nGLASTGS正常組80.79±0.100.91±0.13模型組80.44±0.13?0.55±0.08?銀杏葉組80.60±0.10?△0.70±0.06?△活血通絡利水方低劑量組80.65±0.15?△0.77±0.09?△活血通絡利水方高劑量組80.75±0.10△#0.84±0.18△#

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與銀杏葉組比較，#P<0.05

注：1為正常組；2為模型組；3為銀杏葉組；4為活血通絡利水方低劑量組；5為活血通絡利水方高劑量組

圖1 各組含藥血清在高濃度GLU環境下對Müller細胞GLAST、GS蛋白表達的影響

由表2、圖1可見，與正常組比較，模型組、銀杏葉組、活血通絡利水方低劑量組Müller細胞GLAST、GS蛋白表達水平降低(P<0.05)，而活血通絡利水方高劑量組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，銀杏葉組和活血通絡利水方低、高劑量組Müller細胞GLAST、GS蛋白表達升高(P<0.05)；與銀杏葉組比較，活血通絡利水方高劑量組Müller細胞GLAST、GS蛋白表達升高(P<0.05)。活血通絡利水方低、高劑量組組間Müller細胞GLAST、GS蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組含藥血清對Müller細胞胞外GLU含量的影響 見圖2、表3。

①為GLU對照品溶液；②為正常培養液；③為銀杏葉含藥血清培養液；④為活血通絡利水方含藥血清培養液

圖2 各組含藥血清HPLC色譜圖

組 別n胞外GLU含量(mmol/L)模型組82.43±0.12銀杏葉組82.12±0.21?活血通絡利水方低劑量組82.18±0.19?△活血通絡利水方高劑量組82.06±0.16?△

與模型組比較，*P<0.05；與銀杏葉組比較，△P>0.05

由圖2可見，各組樣品中GLU的分離度良好，各組培養液中的內源性物質及其他雜質峰不干擾GLU的測定，專屬性理想。

由表3可見，與模型組比較，銀杏葉組和活血通絡利水方低、高劑量組Müller細胞胞外GLU含量降低(P<0.05)，即細胞對GLU的攝取能力增強；與銀杏葉組比較，活血通絡利水方低、高劑量組胞外GLU含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。活血通絡利水方低、高劑量組組間Müller細胞胞外GLU含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

缺血性眼病累及視網膜和視神經時，往往影響患者視力，嚴重者甚至視力喪失。現代醫學認為，缺血性視網膜病變的重要原因之一為高濃度GLU對RGC的神經毒性損傷[6]。GLU是中樞神經系統中含量最多、十分重要的興奮性氨基酸，在視網膜內亦作為主要神經遞質介導信息傳遞，其主要聚集、貯存在光感受器、雙極細胞和RGC，沖動傳導時經突觸短暫釋放。Müller細胞作為視網膜最主要的神經膠質細胞，包繞并接觸視網膜各級神經元，參與神經遞質代謝[7]。正常狀況下，Müller細胞通過GLU轉運體GLAST攝取突觸間隙多余的GLU，經GS作用轉化為無神經毒性的谷氨酰胺，再釋放到胞外由神經細胞攝入繼續轉化為GLU釋放到突觸間隙，即為GLU循環[8]。視網膜缺血、缺氧時，GLU被大量釋放，突觸間隙的GLU不能被及時清除而濃度升高，過度刺激其受體，引起細胞內Ca2+超載，啟動級聯反應，導致神經細胞代謝衰竭而損傷死亡，進一步加重缺血、缺氧損傷，形成惡性循環，最終影響視功能[6]。由此可見，調節Müller細胞保護RGC免受高濃度GLU神經毒性損傷具有重要意義，而這一過程中GLAST、GS的作用十分重要。

張銘連教授在中醫學絡病理論的基礎上結合多年臨床診治經驗，提出了“目絡學說”，強調目絡是眼部運行氣血、貫通榮衛的樞紐和要道[9]。若目絡受邪，則氣行不暢，血行滯澀，產生瘀血、痰濕，相互搏結釀生毒邪，損傷目絡，虛、瘀、毒、水4種病理因素互相影響，形成惡性循環，終致目絡瘀阻，發為缺血性眼病[10]。現代醫學已證實的視網膜高濃度GLU對RGC的神經毒性損傷，正是毒邪蘊結、損傷目絡的體現之一。張教授在該學說的指導下，基于清代王清任的補陽還五湯以及臨床實踐，創立了活血通絡利水方，臨證加減組方治療缺血性眼病療效顯著[2-3]。活血通絡利水方以活血化瘀、益氣通絡為治則，方中黃芪為補氣之要藥，大補元氣以助血運行，祛瘀通絡；當歸尾補血，協同行血；川芎、丹參、赤芍活血行滯，以復氣機；葛根、石菖蒲輕揚升發，宣氣通竅；郁金行氣解郁，涼血祛瘀；桃仁、紅花活血破瘀；水蛭破血祛瘀。全方養血與活血藥同用，補氣與通絡藥并使，相得益彰[11]。高血壓、動脈粥樣硬化、血管痙攣或血栓阻塞等均為缺血性眼病的重要病因[12]。現代藥理研究表明，黃芪可以調控血管平滑肌細胞，擴張血管，調整血壓，控制血流，并且改善血液流變學和微循環，增強毛細血管功能，延緩動脈硬化，抑制血小板聚集[13]。川芎所含川芎嗪、阿魏酸具有促進血管舒張、抑制血栓形成的作用[14]；丹參能調節血脂代謝，降低血液黏稠度，延緩動脈粥樣硬化的發生[15]；葛根的主要有效成分葛根素能降低血糖，改善血管功能，增加局部血液灌注[16]。

相關研究證明，活血通絡利水方能保護兔視網膜缺血—再灌注損傷，減輕視網膜水腫，其機制可能與減輕視網膜氧化應激損傷和炎性反應、改善Müller細胞水液代謝、抑制血-視網膜屏障通透性升高有關[17-18]。Müller細胞作為視網膜主要的神經膠質細胞，不僅參與維持視網膜水液穩態，亦維持視網膜正常GLU代謝，保護視功能。因此，對Müller細胞GLU代謝功能的測定能夠進一步探究活血通絡利水方的作用機制。在實驗研究中，通過檢測Müller細胞GLAST、GS蛋白表達水平和細胞外GLU含量，進而評價Müller細胞GLU代謝功能[19-20]。本研究通過體外培養Müller細胞，觀察活血通絡利水方含藥血清低、高劑量組在高GLU環境下對Müller細胞GLAST、GS蛋白表達和胞外GLU含量的影響，以探究活血通絡利水方對Müller細胞GLU代謝功能的調節作用。

觀察結果表明，活血通絡利水方能夠有效促進高GLU環境下Müller細胞GLAST、GS蛋白表達和活性。10 mmol/L 及以下低濃度 GLU 促進Müller細胞活性；20、25、30 mmol/L GLU 抑制 Müller 細胞活性，造成細胞損傷，抑制作用隨 GLU 濃度升高而增強；且 GLU 濃度為 25 mmol/L 時，引起細胞毒性損傷的同時大部分細胞尚存活，成功建立 GLU 損傷細胞模型。與正常組比較，模型組Müller細胞GLAST、GS蛋白表達水平降低(P<0.05)，說明高濃度GLU抑制Müller細胞GLAST、GS蛋白表達；與模型組比較，銀杏葉組和活血通絡利水方低、高劑量組Müller細胞GLAST、GS蛋白表達升高(P<0.05)，并且細胞外GLU含量均降低(P<0.05)，說明藥物干預能夠挽救Müller細胞GLAST、GS蛋白表達和活性，促進Müller細胞代謝GLU。其中，活血通絡利水方高劑量組的調節作用更為明顯，該組Müller細胞GLAST、GS蛋白表達水平與銀杏葉組比較差異有統計學意義(P<0.05)，與正常組和活血通絡利水方低劑量組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，說明活血通絡利水方高劑量組對Müller細胞GLAST、GS蛋白表達的上調作用更強，可以恢復到正常水平，優于銀杏葉組。然而，活血通絡利水方高劑量組胞外GLU含量較低劑量組和銀杏葉組均降低，但比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明活血通絡藥物干預能夠恢復 Müller 細胞 GLAST、GS 蛋白活性，但不同劑量組組間比較差異無統計學意義。綜上所述，本研究證實了活血通絡利水方含藥血清能夠對高GLU環境下Müller細胞GLAST、GS蛋白表達和活性發揮正向調節作用，進而調節GLU代謝平衡，進一步豐富了活血通絡利水方治療缺血性眼病的作用機制研究。