多肽N端修飾方法研究進(jìn)展

廖秀飛，姜 和，蘇春麗，廖洪利，萬(wàn)陽(yáng)裕

(1.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；2.四川科倫藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 610071)

多肽作為生物體內(nèi)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能的活性物質(zhì)，因其相對(duì)于小分子化學(xué)藥物有一定優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為新藥研究的一個(gè)重要方向。但由于穩(wěn)定性差等原因，大大限制了其應(yīng)用，而通過(guò)對(duì)多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可以改善其理化性質(zhì)，進(jìn)而提高穩(wěn)定性，使其擁有更高的生物活性。修飾后的多肽具有更好的脂水分配系數(shù)，易于透膜吸收。研究[1-4]表明，修飾后的多肽可以明顯減小藥物的毒副作用，延長(zhǎng)半衰期，提高藥物療效。

常見(jiàn)的多肽修飾有：磷酸化[5]，是一種翻譯后修飾方式，常見(jiàn)的磷酸化目標(biāo)是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；糖基化[6]，參與生物發(fā)育、代謝等重要生命過(guò)程，比如蛋白質(zhì)N-糖基化修飾；環(huán)化[7]，多肽的環(huán)化分為頭尾相連式、側(cè)鏈與終端連接、側(cè)鏈與側(cè)鏈連接，其側(cè)鏈一般通過(guò)二硫橋進(jìn)行連接，是多肽提高穩(wěn)定性的常用方法。作者重點(diǎn)介紹了化學(xué)合成中多肽N端的修飾方法，為相關(guān)研究提供參考。

1 常用多肽N端修飾方法

1.1 乙酰化

乙酰化是多肽合成中最常用的N端修飾方法，一般采用醋酐對(duì)N端進(jìn)行酰化保護(hù)，避免多肽N端氨基不穩(wěn)定而被氧化。

Yun等[8]研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體2拮抗劑四肽Arg-Leu-Tyr-Glu(RLYE)被不耐熱血清因子降解(圖1)時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于氨基肽酶B和N的降解，使得RLYE在血清中的半衰期較短(1.2 h)。為了提高RLYE的穩(wěn)定性和效力，設(shè)計(jì)了N端乙酰化RLYE(Ac-RLYE)，與原始母體肽RLYE相比，Ac-RLYE在血清中具有8.8 h的穩(wěn)定半衰期，Ac-RLYE對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的IC50值從母體肽的89.1 pmol·L-1降至約37.1 pmol·L-1；并且使用小鼠異種移植腫瘤模型，證明了Ac-RLYE比RLYE在抑制腫瘤血管生成和生長(zhǎng)、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞連接和腫瘤血管的周細(xì)胞覆蓋、改善血管完整性和正常化以及阻止巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等方面更有效。

(a)RLYE的化學(xué)結(jié)構(gòu) (b)RLYE與磷酸鹽緩沖液(PBS)或健康人血清(serum)在37 ℃孵育不同時(shí)間后的濃度曲線。反應(yīng)混合物通過(guò)反相高效液相色譜法分級(jí)，肽濃度通過(guò)220 nm處吸光度作為保留值的函數(shù)積分來(lái)分析(n=3)。內(nèi)插圖是RLYE在健康人血清中孵育不同時(shí)間的典型HPLC圖譜 (c)健康人血清在不同溫度下預(yù)熱10 min，然后與RLYE在37 ℃孵育2 h的HPLC圖譜

圖1 RLYE被不耐熱血清因子降解曲線
Fig.1 Degradation curve of RLYE by heat-labile serum factor

1.2 PEG(聚乙二醇)修飾

PEG是一種中性、無(wú)毒、具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好生物相容性的化學(xué)物質(zhì)，被FDA批準(zhǔn)可作為體內(nèi)注射用藥。在多肽合成中常使用PEG對(duì)N端進(jìn)行修飾[9]，經(jīng)PEG修飾過(guò)的蛋白質(zhì)藥物[10-11]具有更強(qiáng)的生物活性。PEG修飾的脂質(zhì)體[12]對(duì)腫瘤有更強(qiáng)的被動(dòng)靶向作用、更長(zhǎng)的半衰期、較低的最大血藥濃度，由于其血藥濃度波動(dòng)較小，毒性減弱，溶解性提高，從而提高病人的依從性，提高生活質(zhì)量，降低治療費(fèi)用。

Wu等[13]研究用于治療身材矮小、腎衰竭和特納氏綜合癥兒童的人類生長(zhǎng)激素(hGH)時(shí)發(fā)現(xiàn)，hGH的臨床應(yīng)用受到其血漿半衰期短和生物利用度低的困擾，PEG修飾和與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合是延長(zhǎng)hGH血漿半衰期的兩種最有效方法，PEG和HSA的空間屏蔽作用會(huì)大大降低hGH的生物活性，這與藥代動(dòng)力學(xué)相反。以PEG(3.5 kDa或10 kDa)為連接基，通過(guò)PEG-十六烷(HD)對(duì)hGH進(jìn)行N端修飾，合理設(shè)計(jì)制備了具有明顯改善藥理作用的長(zhǎng)效hGH-PEG-HD(圖2)。PEG修飾和與十六烷結(jié)合的HSA可以增加流體動(dòng)力學(xué)體積并降低hGH的免疫原性，從而顯著增加hGH的pK值。

1.3 熒光試劑修飾

熒光試劑是在紫外-可見(jiàn)-近紅外區(qū)有特征熒光，并且其熒光性質(zhì)(激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)、強(qiáng)度、壽命、偏振等)可隨環(huán)境(極性、折射率、黏度等)的改變而靈敏改變的一類熒光性分子，一般用于熒光免疫法中抗原或抗體的標(biāo)記，還可用作熒光探針[14]。在多肽合成中使用熒光試劑對(duì)N端進(jìn)行修飾，比如異硫氰酸熒光素(FITC)，使其具有熒光特性，可用于生物體內(nèi)活性物質(zhì)或者藥物分布的標(biāo)記。

內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的重要標(biāo)志。Xu等[15]研究了一種新型的磁性介孔硅納米粒子，該納米粒子能夠?qū)⑺幬镞f送并靶向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，以此來(lái)診斷和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。使用摻入到Fe3O4@SiO2中的FITC和VHPKQHR肽構(gòu)建納米顆粒FITC-VHP-Fe3O4@SiO2，該納米顆粒在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的形態(tài)特征、優(yōu)異的靶向能力、低毒性和良好的生物相容性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)ITC-VHP-Fe3O4@SiO2是磁共振成像(MRI)的優(yōu)異造影劑，可用于診斷動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。

圖2 hGH-PEG3.5-HD和hGH-PEG10-HD的合成示意圖Fig.2 Synthetic diagram of hGH-PEG3.5-HD and hGH-PEG10-HD

1.4 多肽N端親水性基團(tuán)修飾

多肽的水溶性大小在純化時(shí)非常重要。在多肽純化過(guò)程中，粗品的溶解需要低比例的有機(jī)相以獲得更適宜的水相與有機(jī)相濃度梯度范圍。對(duì)于疏水性較強(qiáng)的多肽，水溶性較差就會(huì)影響純化效果。Chandrashekar等[16]采用連接咪唑的吡喃葡萄糖氧羰基和吡喃半乳糖氧羰基在一定條件下與目標(biāo)肽VVEKFLKRAE反應(yīng)，不僅修飾多肽N端，還與多肽側(cè)鏈氨基進(jìn)行反應(yīng)(圖3)。由于碳水化合物具有多個(gè)親水基團(tuán)，可提高目標(biāo)肽的水溶性，因此利用碳水化合物作為保護(hù)基團(tuán)時(shí)，后續(xù)反應(yīng)還可以在含水條件下進(jìn)行。

圖3 多肽N端親水性基團(tuán)修飾示意圖Fig.3 Schematic diagram of N-terminal hydrophilic group modification of polypeptides

1.5 NCL、EPL連接反應(yīng)

NCL連接反應(yīng)又叫作自然化學(xué)連接反應(yīng)[17]，是用C末端具有硫酯的肽和N末端為半胱氨酸的肽，在中性常溫條件進(jìn)行反應(yīng)。該方法利用多肽本身的官能團(tuán)，延長(zhǎng)肽鏈合成的長(zhǎng)度，提高產(chǎn)率，反應(yīng)機(jī)理是硫-氮酰基轉(zhuǎn)移。基于NCL連接反應(yīng)，F(xiàn)lavell等[18]開(kāi)發(fā)了EPL連接反應(yīng)(圖4)，它是一種半合成技術(shù)，其中由內(nèi)含肽融合蛋白硫解產(chǎn)生的重組蛋白硫酯與具有N末端半胱氨酸的合成或重組肽反應(yīng)形成天然肽鍵。EPL與NCL的主要區(qū)別在于重組表達(dá)的蛋白質(zhì)比多肽分子量更大，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，硫酯與多肽的融合是通過(guò)重組蛋白剪接過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，被廣泛用于生物物理探針的結(jié)合以及非天然氨基酸和蛋白質(zhì)翻譯后修飾。

2 其它多肽N端修飾實(shí)例

2.1 2-氨基辛酸修飾抗菌肽AMP

脂肪酸的N端修飾有一定的限制，需要使用其它物質(zhì)對(duì)多肽進(jìn)行連接，過(guò)程較為復(fù)雜。Almahboub等[19]研究了一種脂肪酸——2-氨基辛酸(2-AOA)，使用來(lái)源于紫黃桿菌的轉(zhuǎn)氨酶，其轉(zhuǎn)化效率為52%～80%；2-氨基辛酸分別與乳鐵蛋白肽B衍生的抗菌肽的C端和N端結(jié)合，可將抗菌肽AMP(序列：RRWQWRMKK)的抗菌活性提高16倍以上；C末端修飾肽的最小抑制濃度總是低于N末端結(jié)合肽的，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等有較好的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，為2-氨基辛酸用于多肽N端修飾和提高抗菌肽的活性提供了研究基礎(chǔ)。

圖4 EPL連接反應(yīng)示意圖Fig.4 Schematic diagram of EPL ligation reaction

2.2 丁烯酶1介導(dǎo)多肽N端修飾

Hemu等[20]發(fā)現(xiàn)天冬酰胺內(nèi)蛋白酶(AEP)家族的半胱氨酸蛋白酶——丁烯酶1可以催化天冬酰胺與半胱氨酸形成硫酯中間體，通過(guò)N端胺的親核進(jìn)攻發(fā)生硫-氮酰基轉(zhuǎn)移，從而形成新的肽鍵(圖5)。丁烯酶1是修飾肽和蛋白質(zhì)的有效通用工具，可使用丁烯酶1進(jìn)行位點(diǎn)特異性肽和蛋白質(zhì)連接、N末端標(biāo)記、硫酯的制備和樹(shù)枝狀大分子的生物偶聯(lián)。

特征識(shí)別信號(hào)NHV占據(jù)了S1-S1′-S2′空穴結(jié)構(gòu);R、R1和R2分別代表P2、P1″和P2″位殘基的氨基酸側(cè)鏈

2.3 N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸的合成

Burov等[21]用Wang聚合物的α-胍基葡萄糖酸環(huán)化，再用三氟乙酸進(jìn)行切割，可以得到N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸(圖6)，為N-脒基-焦谷氨酸殘基用于合成短肽打下基礎(chǔ)。

2.4 N-terminal caps

圖6 N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸的合成Fig.6 Synthesis of N-amidino-pyroglutamyl-phenylalanine

Juhl等[22]研究發(fā)現(xiàn)了一些N-terminal caps結(jié)構(gòu)(圖7)。Apelin-APJ信號(hào)通路與高血壓、心血管疾病、免疫以及神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，但是Apelin peptide代謝穩(wěn)定性低、半衰期短，經(jīng)N-terminal caps修飾后可以提高Apelin peptide的穩(wěn)定性，促進(jìn)藥物開(kāi)發(fā)和體內(nèi)研究。

圖7 用作五元環(huán)和六元環(huán)的N-terminal capsFig.7 N-terminal caps used in five or six membered rings

3 展望

多肽固相合成法的成功開(kāi)發(fā)與應(yīng)用為多肽的化學(xué)合成帶來(lái)了革命性的突破，大大提高了多肽的合成效率。目前，針對(duì)多肽結(jié)構(gòu)修飾的方法逐漸豐富，人們可根據(jù)不同目的選擇適宜的修飾方法，其中小分子保護(hù)基團(tuán)的研究已經(jīng)較為成熟，F(xiàn)moc用于氨基酸的保護(hù)也普遍適用，但是對(duì)于親水性保護(hù)基團(tuán)的研究仍顯不足，可以考慮從其它碳水化合物入手，如將六元環(huán)的吡喃糖換成五元環(huán)的呋喃糖，或者選用其它雜環(huán)替換咪唑基團(tuán)。此外，多肽的儲(chǔ)存條件較為嚴(yán)苛，須低溫冷鏈運(yùn)輸保存。開(kāi)發(fā)提高多肽穩(wěn)定性的修飾方法是一個(gè)值得研究的領(lǐng)域。