StBAG3基因介導的馬鈴薯對晚疫病抗性研究

侯丁一,張曉蘿,康立茹,趙 君,張之為

(1.內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院,內蒙古 呼和浩特 010018；2.呼和浩特市園林科研植保站,內蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上的第四大食用作物[1],目前已經成為最普遍、最重要的非谷類糧食作物,因此,維護馬鈴薯的安全生產已成為世界糧食安全的重要保障之一。據聯合國糧農組織統計,我國2016年的馬鈴薯種植面積達到了581.51 hm2,年產量達9 912.24萬t,是世界第一大馬鈴薯生產國[2]。馬鈴薯產業已經發展成為我國農村經濟支柱的產業之一[3]。但是,由于疫霉菌(Phytophthorainfestans)侵染導致的晚疫病嚴重發生,造成馬鈴薯產量和品質的下降,從而制約了我國馬鈴薯產業的發展[4]。每年由于馬鈴薯晚疫病對馬鈴薯造成的減產為10%～20%,病害發生嚴重時期減產可高達50%～70%,甚至絕收[5]。因此,挖掘抗病基因,并利用基因工程手段進行抗晚疫病育種,對保障馬鈴薯產業的安全具有非常重要的意義[6]。

植物對病原菌侵染的抗性反應最初表現為細胞死亡,稱之為過敏反應(Hypersensitive response,HR)[7]；在過敏反應發生后,被侵染植株則會產生抗性,甚至具有了很強的廣譜抗性,稱為系統獲得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR)[8]。已有研究表明，H2O2是誘導植物HR反應的信號分子之一[9-10],Houot等[9]發現H2O2具有誘導煙草細胞程序性死亡的功能。H2O2作為活性氧(Active oxygen,AO)組成中的一員,通過誘發過敏性壞死反應,使得植物具有了抵抗病原菌侵染的第一道防線[11]；同時,H2O2的大量積累還可以直接殺死病原菌并且參與植物細胞壁增厚和木質素的合成過程[12]。但是過高濃度的活性氧會對寄主植物造成損傷,而ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等則起到平衡植物體中活性氧濃度的作用。SOD是一類含金屬的酶類,可將超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣。SOD還能去除單線態氧,防止羥自由基的形成,并且已被認為是清除ROS的最基本防御機制。CAT可將H2O2分解成水和氧氣,而POD活性的增加與木質素類物質積累以及過敏反應的啟動有關[13-14]。因此,活性氧參與一系列抗病防御反應,其代謝水平的調控在植物與病原物互作中扮演著重要的角色[15]。

BAG(Bcl-2 associated athanogene)是一類具有多種功能的蛋白家族,具有與細胞凋亡和腫瘤發生相關的各種功能[16]。BAG基因的首次發現于小鼠胚胎cDNA文庫中[17],目前,已經確定人類基因組中有6個BAG家族成員,它們可以調節多種生理過程,如細胞凋亡、腫瘤發生等[18-19]。而植物中的AtBAG1～AtBAG4的結構與動物中的BAG非常相似,預示著其功能可能與該同源蛋白在動物中的功能相似[16]。有人認為BAG蛋白不僅通過結合鈣調蛋白,還可以通過結合其他的蛋白來實現細胞內的信號傳遞,使其能夠調控植物葉片衰老以及對逆境的響應等生理過程[20-21],而且在擬南芥的耐寒、抗旱和耐鹽性中都具有一定的功能[22-23]。也有研究表明，BAG蛋白可能與植物的抗病性有關。為了證實上述的研究結果,研究者對敲除AtBAG4和AtBAG6后的擬南芥接種灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea),結果表明AtBAG4和AtBAG6介導植物對病原菌的防衛反應[22]。Ghag等[24]在利用香蕉中細胞凋亡相關基因構建轉基因過表達香蕉植株的過程中發現,過表達MusaBAG1的轉基因香蕉植株對香蕉的枯萎病菌(Fusariumoxysporum)抗性增強。

本研究以馬鈴薯葉片為試驗材料,利用農桿菌介導的瞬時表達體系,分別從接種部位病斑大小的變化、壞死細胞的數量、H2O2水平以及ROS清除酶的活性等方面初步探究了馬鈴薯的StBAG3在對晚疫病抗性建立過程中可能具有的功能,此研究結果為后續深入研究StBAG3基因在馬鈴薯抗性建立過程中的調控機制奠定一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試病原菌：馬鈴薯晚疫菌由內蒙古農業大學園藝與植物保護學院植物分子病理實驗室保存,其交配型為A1型；供試馬鈴薯材料：人工氣候箱內生長30 d的夏坡蒂葉片；供試農桿菌：本實驗室存留的含有pCAMBIA1302-GFP-BAG質粒和pCAMBIA1302-GFP質粒的農桿菌LB4404菌株[25]。

1.2 試驗方法

1.2.1 農桿菌介導的瞬時表達 將備好的含有pCAMBIA1302-GFP-BAG超表達載體與空載體的農桿菌菌液室溫靜置3 h后用于接種；用去掉針頭的注射器將含有pCAMBIA1302-GFP-BAG以及空載體的農桿菌菌液分別注射到馬鈴薯離體葉片的背面,24 h后人工接種馬鈴薯晚疫病菌的游動孢子液(1×106個/mL)。

1.2.2 病原菌的接種 將在黑麥培養基上培養20 d的致病疫霉菌轉入裝有無菌水的離心管中,4 ℃下放置3 h誘導游動孢子的釋放,將孢子濃度調至1×106個/mL。在葉片的右側接種10 μL的孢子液,葉片的左側接種水作為對照。將接種葉片放置在光照培養箱中(光照16 h,黑暗8 h,溫度為18～22 ℃,濕度為80%)培養。分別在接種后0,24,48,72,96 h測量病斑的面積,并運用Motic Images Plus 2.0輔助計算接種部位相對病斑面積,相對病斑面積/%=接種部位的病斑面積/(0.25×單個葉片面積),接種情況見圖1。

圖1 馬鈴薯離體葉片瞬時表達StBAG3后接種晚疫菌的示意圖Fig.1 The leaf of potato inoculated with P.infestans after transient expression of StBAG3

1.2.3 染色 采用Zheng等[26]的方法,用臺盼藍對馬鈴薯葉片進行染色；采用Thordal-Christensen等[27]的方法,用DAB對馬鈴薯葉片進行染色。

1.2.4 過氧化氫含量的測定 稱取1 g接種馬鈴薯晚疫病菌后0,24,48,72,96 h后瞬時表達目的基因的葉片,按材料與提取液1∶1的比例加入預冷的丙酮并研磨后,6 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液,加入5%硫酸鈦和濃氨水,待沉淀形成后,6 000 r/min離心10 min,棄上清液。用丙酮洗滌3～5次。加入5 mL 2 mol/L硫酸,待沉淀溶解后,在415 nm波長下測定吸光度。H2O2含量/(μmol/g)=(C×Vt)/(FW×V1),式中,C代表標準曲線上查得的H2O2濃度,Vt代表樣品提取液總體積,V1代表測定時樣品體積,FW代表植物組織鮮質量。

1.2.5 ROS清除酶活性測定 SOD活性的測定采用李合生[28]的NBT顯色法,分別在瞬時表達StBAG3和空載體的葉片上接種馬鈴薯晚疫菌,然后在接種0,24,48,60,72 h后分別取0.1 g新鮮葉片進行測定；POD活性的測定采用郝再彬等[29]的愈創木酚法,取樣方法同上；CAT活性的測定采用李合生[28]的方法,取樣方法同上。

1.3 統計分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0進行數據的統計和分析,在α=0.05水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 瞬時表達StBAG3基因后對馬鈴薯抗晚疫病水平的影響

為了探究StBAG3基因在馬鈴薯抵抗晚疫病菌侵染過程中的作用,以瞬時表達空載體后接種晚疫菌的葉片部位作為對照,測定了在瞬時表達StBAG3基因的馬鈴薯離體葉片上接種晚疫病菌后不同時間點病斑的大小,結果表明(圖2),接種48 h后,當對照的葉片部位開始出現水漬狀的病斑,而瞬時表達StBAG3基因的部位卻基本未見病斑的出現；接種72 h后對照葉片部位病斑面積明顯擴大,但是表達StBAG3基因部位病斑面積只有小幅度增加。直到接種96 h后,當對照葉片從接種部位開始腐爛時,表達StBAG3基因部位病斑面積依然較小。相對病斑面積計算的結果表明,在不同的接種時間點瞬時表達StBAG3基因后的葉片的相對病斑面積分別為0(0 h),0.58%(24 h),2.78%(48 h),3.90%(72 h),6.21%(96 h)；而對照相應接種時間點的相對病斑面積分別為0(0 h),2.50%(24 h),11.58%(48 h),28.29%(72 h),45.36%(96 h)。24，48，72，96 h后接種位置病斑的相對面積較對照病斑顯著減少了1.92～39.15 百分點。顯而易見,瞬時表達StBAG3基因后葉片上病斑相對面積均顯著低于對照,預示著超表達StBAG3基因后能夠提高馬鈴薯對晚疫病的抗性水平。

馬鈴薯離體葉片左側接種水;右側接種晚疫菌。圖3-4同。Potato leaves were inoculated with water on the left and P.infestans on the right. The same as Fig.3-4.

由于臺盼藍染色可以用來定性研究壞死細胞的數量,因此,可以利用接種部位染色面積的大小和顏色定性比較病斑的大小。由圖3可知,在接種24 h后,瞬時表達StBAG3基因部位的死亡細胞數量與瞬時表達空載體的對照沒有明顯的差異,然而在接種48 h后,對照部位藍色的面積以及深度都要大于瞬時表達StBAG3部位,預示著瞬時表達目的基因部位壞死細胞數量少于對照部位。這種差異隨著接種時間的推移更加明顯。由此可知,瞬時表達StBAG3基因后葉片死亡細胞數量少是直接導致接種部位病斑變小的主要原因。

圖3 瞬時表達StBAG3葉片接種晚疫菌后死亡細胞數量的檢測(臺盼藍染色)Fig.3 The number of dead cells detection of leaves inoculated with P.infestansafter transient expression of StBAG3(Trypan blue staining)

2.2 瞬時表達StBAG3基因后對馬鈴薯離體葉片中H2O2產生的影響

過氧化氫的大量積累往往被認為是標定植物抗病水平的一個重要指標,因此,過氧化氫濃度的定量測定能夠客觀的反映接種部位的抗性水平。為了明確瞬時表達StBAG3基因后導致的病斑變化原因是否為過氧化氫積累水平,對瞬時表達目的基因和空載體后馬鈴薯離體葉片進行晚疫病菌接種,對接種后不同時間點的葉片中過氧化氫的水平進行測定。結果表明(圖4),在接種48 h之前,瞬時表達目的基因和對照部位的過氧化氫都表現出相同的小幅度上升趨勢,但二者沒有顯著差異；接種48 h后,瞬時表達StBAG3基因部位的過氧化氫積累的水平急劇增加,接種72 h后達到一個高峰值,為0.146 μmol/g,而此時間點對照葉片中的過氧化氫含量僅為0.086 μmol/g,盡管對照樣本相比前面的接種時間點仍然有上升的趨勢,但是增加幅度較??；從接種72 h后開始,瞬時表達StBAG3基因部位的過氧化氫的積累量從第一個峰值開始下降到0.120 μmol/g,而對照相應的也從最高點降低到0.071 μmol/g,在這一時間點,二者在過氧化氫積累水平上仍然表現出顯著的差異。在相同的試驗設計下利用DAB染色定性測定的結果和定量測定結果基本一致,即在接種72 h后,過氧化氫在瞬時表達目的基因的部位顏色和面積明顯高于對照部位,且這種差異到接種96 h后雖然有所緩解,但是仍然存在一定的差異。上述的結果表明過氧化氫參與了StBAG3介導的馬鈴薯對晚疫病的抗性過程。

圖4 瞬時表達StBAG3基因后定量和定性檢測接種部位H2O2的積累量Fig.4 Quantitative and qualitative detection of accumulation of H2O2 in inoculation areas after transient expression of StBAG3

2.3 瞬時表達StBAG3基因后對ROS清除酶活性的影響

為了進一步確定瞬時表達StBAG3基因后能夠誘導H2O2的積累,對瞬時表達目的基因和對照的離體馬鈴薯葉片接種不同的時間點后的ROS清除酶活性進行了測定。結果表明(圖5)，不同的ROS清除酶活性在接種后不同時間點的變化趨勢明顯的不同。人工接種后,CAT酶的活性在瞬時表達目的基因的葉片中以及對照葉片中均呈現“先降低后升高再降低又升高”的變化模式,并分別在接種后48,96 h形成2個峰值,分別為0.061,0.041 U/(g·min)和0.074,0.040 U/(g·h)；瞬時表達目的基因葉片中CAT活性均高于對照葉片,其中接種后48～96 h二者差異顯著。SOD活性在接種后的瞬時表達目的基因葉片中呈現出“先降低后升高再降低”的變化模式,在接種72 h時出現1個高峰值,而在對照葉片中接種后的各時間點卻無顯著變化,除接種后24 h外,其他時間點瞬時表達目的基因葉片SOD活性均顯著高于對照葉片；POD酶活性在瞬時表達目的基因葉片以及對照葉片中均呈現上升的態勢,且二者之間在除96 h外的其他時間點均無顯著差異,在接種96 h后,瞬時表達目的基因葉片中POD酶活性顯著高于對照葉片。

圖5 瞬時表達StBAG3基因后接種葉片ROS清除酶活性的變化Fig.5 Variation of ROS scavenging enzymes activity of leaves after transient expression of StBAG3 and inoculated with P.infestans

3 結論與討論

研究表明,當植物遇到外界刺激時,比如病原菌侵染,植物往往會有一系列的應激反應,從而提高植物自身的抵抗能力,HR反應就是植物抵抗病原的一個最為強烈且典型的抗性反應。而過氧化氫是誘發HR反應最重要的因素[10]。本研究以本實驗室已經克隆得到的馬鈴薯中的Bcl-2結合抗凋亡基因StBAG3為研究對象,利用農桿菌介導的瞬時表達體系,研究了StBAG3基因在馬鈴薯抗性建立過程中可能具有的功能,并初步探究了過氧化氫在StBAG3基因介導馬鈴薯抗性建立過程中的作用,旨在為馬鈴薯的抗病育種提供新的思路。初步的研究結果表明,StBAG3基因能夠提高馬鈴薯對晚疫病的抗性水平。在You等[30]對水稻中的OsBAG4基因的研究結果表明,由于OsBAG4過量積累,導致誘發先天性免疫表型和自發的細胞死亡、活性氧積累現象,從而使得水稻產生先天性免疫和廣譜抗病性；Kabbage等[31]發現擬南芥中的AtBAG6可以通過被蛋白酶水解從而被激活,進而誘導植物產生對病原菌的抗病性。上述的研究結果和本研究結果相似。

此外,定性和定量檢測的結果表明過氧化氫在StBAG3基因介導的馬鈴薯抗性建立過程中也發揮非常重要的作用。Patykowski等[32]發現2個抗病性不同的番茄品種在受到灰霉病菌(Botrytiscinerea)侵染后均能檢測到H2O2含量升高,并且抗病品種較感病品種出現的早,生成量更高,說明H2O2與植物抗病性緊密相關,在受到病原菌侵染時參與了植物體自身的防御反應。林志強等[33]研究發現,外源施加H2O2能減緩葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)侵染過程,降低發病率和病情指數。黃貝梅[34]的研究表明,溫室條件下,抗病和感病的沙打旺植株在接種埃里磚格孢菌(Embellisiaastragali)后,H2O2含量均高于未被侵染的植株,而未被侵染的植株H2O2含量相對穩定。施加外源H2O2后,感病沙打旺的病情指數和發病率均顯著低于對照,并且有效提高了POD、CAT、SOD等酶對抗病過程的調節作用,從而強化了寄主的病害防御體系,增加了對埃里磚格孢菌的抗性。以上研究結果與本試驗的研究一致,均表明了H2O2參與了植物的抗性過程的建立。據已有研究表明,HR反應通過細胞程序性死亡實現,該反應發生時,胼胝質含量增高[35-36]。而過表達AtBAG6的植株細胞中的胼胝質含量也顯著增加,這說明AtBAG6參與植物對生物脅迫的應答可能是通過調節HR反應來實現的。而活性氧能夠誘導MAPK激酶,使HR反應中的細胞程序性死亡發生[37-38]。所以,在本試驗中H2O2含量的增加可能是因為StBAG3的過表達誘導了接種晚疫菌的葉片的HR反應。另一方面,ROS易對細胞造成毒害,此時需要ROS清除機制來降低ROS的毒害[39-40],本試驗中ROS清除酶活性出現不同程度的升高,可能因為H2O2含量的增加。

本研究利用瞬時表達體系得到了有關StBAG3基因調控馬鈴薯抗性的一些初步結果,但是由于瞬時表達體系相比穩定表達StBAG3株系具有一些缺點,如該方法技術條件要求高并且得到的蛋白質產物保存的時間較短,這些缺點將會限制研究者對StBAG3基因的調控模式、調控信號網絡等進行深入細致的研究。因此,利用農桿菌介導的遺傳轉化獲得穩定表達上述目的基因的轉基因株系,以及利用RNAi或VIGS體系對內源的目的基因進行沉默是研究上述基因在馬鈴薯抗病乃至抗逆過程中調控功能的當務之急。