拮抗灰霉病菌的芽孢桿菌篩選、鑒定及其代謝產物抑菌效果研究

劉昆昂,黃亞麗,賈振華,馬 宏,宋水山

(1.河北省科學院 生物研究所,河北 石家莊 050081；2.河北科技大學,河北 石家莊 050018；3.河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心,河北 石家莊 050081)

由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病能夠侵染包括黃瓜、番茄、草莓等蔬菜水果在內的200多種植物,該病害在植物生長期和采后均可發生,每年給世界農業造成數十億的經濟損失[1-3]。目前,灰霉病依然以化學防治為主,長期重復用藥導致灰霉病菌對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類和氨基甲酸酯類三類常用殺菌劑的抗藥性增強,農藥防效降低、用量增大,也加劇了對生態環境的威脅[4-6]。因此,尋找一種生態安全、效果穩定的灰霉菌防治方法至關重要。

生物防治是目前最具潛力并具有良好農藥替代效果的植物病害安全防治技術[4],灰霉病的生物防治已經成為研究者關注的焦點。從多種生境中篩選出對灰葡萄孢菌具有抑制作用的芽孢桿菌(Bacillusspp.)[7]、木霉(Trichodermaspp.)[8]、鏈霉菌(Streptomycesspp.)[9]等生防菌株。芽孢桿菌由于其性能穩定、易于貯存是灰霉病害防治中應用最多的生防微生物。小麥內生枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Em7對葡萄灰霉病菌的生長具有抑制作用,離體果實相對防治效果為78.92%[10]。張新剛等[11]研究表明,貝萊斯芽孢桿菌SFJ1發酵液對盆栽黃瓜接種灰霉病4,7 d后的防效分別為86.48%,84.09%。這些研究為生防微生物菌劑的開發和田間應用積累了菌株資源和應用基礎。目前，已經登記了包括枯草芽孢桿菌、哈茨木霉在內的多種灰霉病防治微生物菌劑。然而,生防菌劑的應用效果由于活體微生物定殖受諸多因素的影響,導致防治效果不穩定[12]。特別是對于灰霉病這種葉部病害來說,由于拮抗菌株的葉面定殖受紫外線、溫度、水分等環境因素影響導致防治效果更為不穩,成為限制灰霉病生物防治的技術瓶頸[13]。利用微生物產生的活性抑菌物質進行灰霉菌的生物防治能夠有效克服活菌制劑防效不穩定的缺點。

本研究以從多個省采集的蔬菜種植土壤樣品為篩選基礎,采用平板對峙法篩選獲得一株具有較強拮抗活性的灰霉菌拮抗菌株,通過形態學、生理生化特征以及16S rRNA和gyrB序列分析將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),并且該菌能夠分泌抑菌效果良好、穩定性較高的胞外抑菌活性物質。該研究為黃瓜灰霉病的生物防治提供新的生物材料和生物防治方式,對灰霉病的有效防治和化學農藥的減量具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑與培養基 細菌基因組提取試劑盒EE161、多重PCR擴增試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PDA培養基：去皮馬鈴薯200.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,瓊脂15 g/L,pH值自然,1×105Pa滅菌20 min；PB液體培養基：牛肉膏5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,pH值7.0,1×105Pa滅菌20 min；PB固體培養基為液體培養基中加入瓊脂15 g/L。

1.1.2 樣品來源 共采集云南、黑龍江、新疆、河北等地蔬菜種植土壤耕層樣品129個；供試病原菌灰葡萄孢菌,由本單位從罹病黃瓜上分離獲得；供試黃瓜品種為津優1號,購于河北省農林科學院種子市場。

1.1.3 儀器 Beckman Coulter Allegra 64R冷凍離心機購自美國Beckman公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf Mastercycler X50梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司；Panasonic高壓蒸汽滅菌器購自日本Panasonic公司。

1.2 拮抗菌的分離篩選與純化

采用稀釋涂平板方法進行細菌分離,土壤經80 ℃水浴10 min逐級稀釋后涂布于PB培養基中,28 ℃培養3 d,挑取形態各異的單菌落連續劃線純化直至得到菌落形態一致,長勢較快的菌株。將得到的菌株進行編號,用30%的甘油于-80 ℃冷凍保存。以灰葡萄孢菌為靶標菌,采用平板對峙法測定保存菌株的拮抗性能。打孔器打取直徑為5 mm的灰葡萄孢菌菌塊并接種于PDA平板中央,挑取細菌單菌落均勻接在距離指示菌3 cm的位置,22 ℃恒溫培養5 d,測量對照組病原菌菌落半徑(R0)和處理組病原菌抑制區半徑(R1),并按公式①計算抑制率。

抑制率=(1-R1/R0)×100%

①

1.3 拮抗菌BA-KA4的鑒定

拮抗菌菌落形態：將待測菌劃線接種于PB培養基上,28 ℃恒溫培養48 h,觀察菌落的大小、形態、顏色、透明度等特征。拮抗菌菌體形態：將待測菌接種于PB液體培養基,180 r/min、28 ℃恒溫培養48 h,采用革蘭氏染色試劑盒進行革蘭氏染色、采用美蘭試劑進行芽孢染色,在光學顯微鏡下觀察菌體形態。拮抗菌生理生化鑒定：參考《常見細菌系統鑒定手冊》[14]和《伯杰細菌鑒定手冊》[15]的方法,對拮抗菌株的明膠液化、硝酸鹽、檸檬酸鹽利用試驗、吲哚試驗、V-P試驗、纖維素等生理生化指標進行測定。拮抗菌株的分子鑒定：采用細菌基因組提取試劑盒提取待測菌株的基因組DNA,以此為模板,以27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物,進行菌株16S rDNA的擴增。PCR擴增條件為: 95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35個循環；72 ℃ 10 min[16]。以UP-1(5′-GAAGTCATCAT GACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和UP-2r(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′)對gyrB基因序列進行擴增。PCR擴增條件為：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s,62 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30個循環；72 ℃ 8 min[17]。將16S rDNA和gyrB基因序列擴增產物送金唯智生物科技有限公司進行測序,所得序列在GenBank數據庫進行Blast比對,采用Mega 7.0軟件與Neighbor-Joining法進行系統發育分析并構建系統發育樹[18]。

1.4 拮抗菌BA-KA4無菌發酵液的抑菌活性和不同濃度無菌發酵液的抑菌效果

拮抗菌無菌發酵液抑菌活性的確定：挑取BA-KA4菌株單菌落接種于PB液體培養基中,28 ℃、180 r/min恒溫培養48 h,經8 000 r/min離心15 min,收集上清液并過孔徑0.22 μm的濾膜得到無菌發酵液。收集離心獲得的菌體,超聲波破碎3 min,用PB培養基稀釋到原體積,經8 000 r/min離心15 min,收集上清液為菌體破碎液。分別吸取1 mL無菌發酵液和菌體破碎液至培養皿中,倒入25 mL PDA培養基,待培養基凝固后,在中央接入直徑5 mm的灰葡萄孢菌菌塊,22 ℃恒溫培養至對照平板菌絲剛長滿平板時(R0),測量不同處理中灰葡萄孢菌的菌落直徑(R1)。采用公式①計算抑菌率。

利用50 ℃的PDA培養基進行無菌發酵液的稀釋,分別稀釋至10,20,40,80,160倍并倒平板,以添加同體積無菌水的PDA平板為對照。用直徑5 mm的打孔器打取活化3 d 的灰葡萄孢菌菌落邊緣的菌塊并接種于含不同濃度無菌發酵液PDA平板和對照平板的中央,22 ℃恒溫培養至對照平板菌絲剛長滿平板時(R0),測量不同處理中灰葡萄孢菌的菌落直徑(R1)。采用公式①計算抑菌率。

1.5 拮抗菌BA-KA4無菌發酵液的穩定性分析

測定溫度、pH值、紫外線3個變量對發酵液穩定性的影響：將無菌發酵液經10,20,30,40,50,60,70,80,90,100 ℃水浴處理30 min以及在121 ℃高壓滅菌15 min；采用濃度0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調節無菌發酵液的pH值至3,4,5,6,7,8,9,并處理30 min；采用功率為15 W的紫外線燈,距離無菌發酵液20 cm的高度照射1,7,11,16 h。按照1.2的方法測定不同處理無菌發酵液20倍稀釋、22 ℃恒溫培養5 d灰葡萄孢菌菌落直徑(R1),以不經處理的無菌發酵液為對照(R0),按照公式②計算相對抑菌率。

相對抑菌率=R1/R0×100%

②

1.6 數據處理

2 結果與分析

2.1 灰霉病拮抗芽孢桿菌菌株的篩選

根據芽孢桿菌的芽孢的耐熱特性,將采集的土樣用80 ℃水浴處理10 min后,通過PB培養基從129個土壤樣品中共分離獲得4 200株細菌。采用平板對峙方法,從中篩選出具有灰霉病菌拮抗作用的菌株191株。對191株拮抗菌進行復篩并比較菌株的拮抗性能,共獲得10株抑菌率超過50%的菌株,其中一株細菌平板對峙試驗72 h對灰霉病菌的抑菌率為65.34%,經方差分析與其他幾株存在顯著性差異(表1、圖1),命名為KA4。

2.2 灰霉病拮抗芽孢桿菌菌株的鑒定

菌株KA4在PB平板中,呈扁平或圓形、乳白色不透明、邊緣整齊、表面有褶皺、中央略凹的菌落(圖2-A)。顯微鏡觀察(圖2-B)為桿狀、單個排列、兩端平滑,大小為(1.1～4.1) μm×(0.2～0.5) μm，革蘭氏染色呈陽性。明膠液化、硝酸鹽、檸檬酸鹽利用試驗、吲哚試驗、V-P試驗、纖維素、淀粉水解、H2S產生試驗均呈陽性,甲基紅、丙二酸鹽、酪氨酸試驗均呈陰性(表2)。

表1 不同菌株對灰葡萄孢菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of rescreening antagonistic strains on B.cinerea

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters after the same column of data indicate significant difference(P<0.05).

圖1 KA4對黃瓜灰霉病菌的拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of strain KA4 on B.cinerea

圖2 拮抗菌KA4菌落和菌體形態Fig.2 Colony and morphology of strain KA4

表2 拮抗菌KA4的生理生化鑒定結果Tab.2 Result of physiological and biochemistry experiments of strain KA4

將菌株KA4的16S rRNA擴增產物測序獲得1 394 bp的片段(圖3),序列提交至GenBank (序列號: MK336717)進行同源性分析,發現菌株KA4與解淀粉芽孢桿菌D6 (序列號: KJ123707)、解淀粉芽孢桿菌R-1 (序列號: AB847954)、解淀粉芽孢桿菌13(序列號: HM107806)、枯草芽孢桿菌B4 (序列號: JX123316)、枯草芽孢桿菌 L4 (序列號: GQ421472)等菌株的同源性均>99%,可以初步推測菌株KA4為芽孢桿菌屬細菌,與解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的相似性較高。為進一步確定菌株KA4的分類學地位,利用Mega 7.0軟件及其Neighbor-Joining法構建系統發育樹(圖4),發現菌株KA4與解淀粉芽孢桿菌D6 (序列號: KJ123707)、解淀粉芽孢桿菌R-1 (序列號: AB847954)、解淀粉芽孢桿菌13(序列號: HM107806)等菌株均處于同一分支,與枯草芽孢桿菌B4 (序列號: JX123316)、枯草芽孢桿菌L4 (序列號: GQ421472)等菌株也處于臨近分支。由于解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的親緣關系比較近,以16S rDNA序列構建的系統發育樹不能確定該菌株的種,因此,選用芽孢桿菌專用的指示基因gyrB對菌株KA4進行了進一步的鑒定。經PCR擴增獲得長度為1 006 bp的片段,提交至GenBank (序列號: MK3434447)并與NCBI中已知的gyrB基因序列進行比對分析,發現菌株KA4與解淀粉芽孢桿菌 GM-1 (序列號: JQ658430)、解淀粉芽孢桿菌FQS38 (序列號: KC439667)、解淀粉芽孢桿菌DM09 (序列號: JX014631)等菌株的同源性均>98%,利用Mega 7.0軟件及其Neighbor-Joining法構建基于gyrB的系統發育樹(圖5),菌株KA4與解淀粉芽孢桿菌的系列菌株聚成一簇。綜合形態學、生理生化特征、16S rRNA、gyrB基因序列和系統發育分析,可以確定菌株KA4為解淀粉芽孢桿菌,命名為BA-KA4。

圖3 菌株KA4的16S rRNA擴增產物片段Fig.3 16S rRNA amplification product fragment of strain KA4

圖4 拮抗菌BA-KA4 依據16S rDNA基因序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain BA-KA4 and related strains based on 16S rDNA sequence

圖5 拮抗菌BA-KA4 依據gyrB基因序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain BA-KA4 and related strains based on gyrB sequence

2.3 拮抗菌BA-KA4無菌發酵液抑菌活性的分析

測定BA-KA4無菌發酵液與細胞破碎液的抑菌活性(圖6),不加無菌發酵液的為對照(圖6-A),結果表明,無菌發酵液對灰葡萄孢菌抑菌率為63.87%(圖6-B),細胞破碎液對灰葡萄孢菌的抑菌率為41.17%(圖6-C),說明BA-KA4主要以胞外分泌物為抑制活性成分。圖7為不同稀釋倍數無菌發酵液對灰葡萄孢菌的抑菌效果,結果顯示,10,20,40,80,160倍無菌發酵液對灰葡萄孢菌的生長均有一定的抑制作用,其中以稀釋10倍抑菌作用最強為78.83%,20,40,80,160倍的無菌發酵液的抑菌率依次為65.19%,45.38%,22.89%,15.97%,隨著稀釋倍數的增大,抑制效果依次減弱。

圖6 BA-KA4無菌發酵液和細胞破碎液對黃瓜灰霉病菌的抑制效果Fig.6 Inhibition effect of BA-KA4 sterile filtrate and cell disrupting solution on B.cinerea

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖8同。Different letters represent significant difference(P<0.05)among treatments.The same as Fig.8.

2.4 拮抗菌BA-KA4無菌發酵液的穩定性分析

測定不同溫度處理的無菌發酵液的抑菌效果表明(如圖8-A),其中10,20,40,60,80,100,121 ℃處理后BA-KA4的相對抑菌率分別為82.59%,92.50%,87.27%,86.55%,86.55%,86.33%,71.58%,其中20 ℃處理顯著高于除40 ℃外的其他溫度處理,121 ℃處理顯著低于其他處理。BA-KA4無菌發酵液分別在pH值3,4,5,6,7,8,9時處理30 min,各pH處理相對抑菌活性依次為55.50%,76.47%,84.75%,90.91%,93.73%,87.92%,85.27%(圖8-B),其中pH值7處理顯著高于除pH值6處理外的其他處理,pH值3處理顯著低于其他處理。紫外線照射無菌發酵液1,7,11,16 h的抑菌活性如圖8-C所示,抑菌活性依次為89.48%,76.28%,66.98%,64.10%,其中紫外線照射1 h處理顯著高于紫外線照射11,16 h處理。綜合而言,無論是溫度、酸堿還是紫外線照射處理,BA-KA4無菌發酵液的相對抑菌活性最低仍可達到55.50%,說明BA-KA4代謝產物具有良好的溫度、pH和紫外線穩定性。

圖8 溫度、pH、紫外照射時間對BA-KA4無菌發酵液抑菌活性的影響Fig.8 Antagonistic effect of BA-KA4 sterile filtrate under different temperatures, pH and UV on B.cinereal

3 討論

化學藥劑的長期大量使用造成病原菌耐藥性增強和環境污染,使得生物防治成為植物灰霉病防控的重要組成部分。為了使灰霉病害的生物防控更為有效,研究者不斷地從不同生境樣品中進行灰霉病生防菌株的挖掘。從土壤、海洋、植物內部以及極端環境中分離篩選出多種的灰葡萄孢菌拮抗菌株,為灰霉病菌的生物防治奠定了菌株基礎。其中,芽孢桿菌由于其生存能力強、分布范圍廣、產生抑菌物質多樣成為灰霉病防治的主要微生物[19]。鄭喜清等[20]從植物根際土壤中分離到對番茄灰葡萄孢菌具有拮抗作用的地衣芽孢桿菌、短芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌。Kefi等[7]從番茄植株中分離到內生莫海威芽孢桿菌BL1、耐鹽短桿菌BT5、枯草芽孢桿菌BR8、解淀粉芽孢桿菌BF11對灰霉病菌具有拮抗效果。本研究從全國不同地區采集土壤樣品,以黃瓜灰霉病菌為指示菌,進行了灰葡萄孢菌拮抗芽孢桿菌菌株的篩選,其中以解淀粉芽孢桿菌BA-KA4對灰葡萄孢菌的拮抗作用最強。解淀粉芽孢桿菌因其生存能力強、抑菌范圍廣以及對人和環境的安全等特點,被認為是最具生防潛力的菌株之一[21]。本研究進一步豐富了灰霉病菌生物防治的菌株資源。

微生物制劑的效果與微生物的定殖能力相關,受溫度、紫外線、微生物區系以及施用藥劑等環境因素的影響。以微生物代謝產物作為生防藥劑進行病害防治可以減少由于微生物活性造成的田間防效不穩的缺點,因此,研究者對芽孢桿菌胞外分泌物進行了大量研究。De 等[22]篩選到5株解淀粉芽孢桿菌對番茄灰霉病的抑制率為52%～61%,其抑菌活性物質主要為表面活性素。夏京津等[23]從解淀粉芽孢桿菌HE中鑒定出ituA、fenB、sfP、mycB的脂肽合成相關基因和Surfactin、Iturin和Fengycin這3類脂肽類抗生素,且產生的抑菌活性物質對高溫、酸、堿和蛋白酶具有一定的耐受性。魏新燕等[24]從海水中分離到了一株甲基營養型芽孢桿菌BH21,該菌株含有ituA、ituB、ituC、ituD、fenD、srfAB 和yndJ等7種脂肽物質的合成基因,推測該菌株的抑菌活性物質是這幾種物質的混合物。總之,大量研究表明芽孢桿菌具有豐富的次級代謝產物,且代謝產物的抑菌活性具有較好的穩定性。Zhang等[25]從番茄根際分離到解淀粉芽孢桿菌W10,該菌株產生的新型小抗菌肽5240在100 °C條件下處理20 min仍保持穩定的抑菌活性,pH值4～10范圍內可以保持抑菌活性。本研究測定了解淀粉芽孢桿菌BA-KA4代謝產物對黃瓜灰霉病的抑制作用,結果表明,該菌株的無菌發酵液具有較強的抑菌活性,而細胞破碎液的抑菌活性較低,說明該菌主要通過胞外分泌物起到拮抗病原菌的作用；該菌株的無菌發酵液稀釋10,20,40,80,160倍對灰葡萄孢菌的生長均有一定的抑制作用,其中以稀釋10倍抑菌作用最強為78.83%,20,40,80,160倍的無菌發酵液也具有一定的抑菌效果,為該菌株代謝產物的田間應用提供參考；該菌株的胞外抑菌物質具有良好的溫度、紫外線和pH穩定性,在121 ℃高溫高壓滅菌15 min的相對抑菌率仍為71.58%,紫外線照射16 h的相對抑菌率仍高達64.10%,該菌株的胞外抑菌物質在pH值3～9處理的情況下相對抑菌率在55.50%～93.73%。這些研究表明,解淀粉芽孢桿菌BA-KA4的代謝產物具有良好的環境穩定性,從而賦予了菌株較好的加工、儲存、藥劑復配性能,適宜進行大規模的生產和田間應用。