MTA1表達(dá)與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及調(diào)控作用的研究

王學(xué)培 翟楊生 韓雪華

作為臨床最常見的惡性消化道腫瘤之一，食管癌(esophageal cancer,EC)具有發(fā)生發(fā)展迅速、侵襲范圍廣、轉(zhuǎn)移速度快、病死率高的特點(diǎn)[1]。依據(jù)現(xiàn)今的外科醫(yī)療條件，早期EC可通過(guò)根治性手術(shù)切除得到理想的治療效果[2]，而晚期EC一般采用手術(shù)與化療相輔助的治療方案，但是EC患者的術(shù)后再次復(fù)發(fā)以及癌細(xì)胞的不可控性轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致EC患者死亡的最重要的因素之一[3]。隨著分子病理學(xué)在臨床應(yīng)用技術(shù)上的突破，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子研究逐漸應(yīng)用在EC的診斷、治療中[4]。惡性腫瘤的基本特征就是侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤相關(guān)蛋白1(metastasis-associated gene 1，MTA1)作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，其在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，且與腫瘤侵襲和腫瘤血管形成有關(guān)[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道稱實(shí)體腫瘤發(fā)生的主要因素就是缺氧，局部缺氧會(huì)誘導(dǎo)激活缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)等，進(jìn)而開啟血管生成開關(guān)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路被激活，進(jìn)而刺激血管和淋巴管生成[6]。有報(bào)道MTA1在大腸癌中表達(dá)與HIF-1α呈正相關(guān)，且能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF促進(jìn)淋巴管生成[7]。而在EC中其促進(jìn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制筆者尚未見報(bào)道。本研究探討MAT1在EC中的表達(dá)，并探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，旨在為臨床診治EC提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3月至2018年5月于我院接受手術(shù)治療的62例EC患者癌組織及距離癌組織>2 cm處的正常組織，所有病例標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)為原發(fā)性EC，其中腺癌32例，鱗癌30例；年齡35～76歲，中位年齡55歲。所有患者同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 細(xì)胞及主要試劑和儀器 人正常食管上皮細(xì)胞HET-1A，人食管癌細(xì)胞株Eca-109、SHEEC1、Ec-9706、EC8712、TE-1均購(gòu)自上海博古生物技術(shù)有限公司。慢病毒過(guò)表達(dá)載體RSK4-MTA1及陰性對(duì)照RSK4-NC由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基(TOYOBO)；Trizol 試劑盒(TaKaRa)；Ⅰ、Ⅲ型膠原兔多克隆抗體(美國(guó)Abcamn公司)，MTA1抗體、HIF-α抗體、VEGF抗體、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(美國(guó)Jackson公司)，Transwell小室(美國(guó)BD公司)；CCK-8試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Western blot試劑盒(美國(guó)migma公司)全蛋白抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，Lipofectamine-3000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)vector公司)；PBS緩沖液(美Amresco公司)蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)(北京六一儀器廠)，SANYO MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)強(qiáng)生公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司)；5810R 型高速離心機(jī)(日本島津公司)；Roche R480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Promega公司)，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Corning公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染 將Eca-109細(xì)胞接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件37℃，5%CO2，融合度達(dá)85%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 3000通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將濃度均為100 nmol/L的RSK4-MTA1和RSK4-NC慢病毒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染操作完成后，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為RSK4-MTA1組、RSK4-NC組以及空白對(duì)照組(僅有Eca-109細(xì)胞，只加入Lipofectamine 3000試劑)。

1.4 組織及細(xì)胞RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)MTA1的mRNA的表達(dá) 組織液和各細(xì)胞中總RNA依據(jù)Trizol法提取，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒要求執(zhí)行。采用SYBR Premix Ex Taq說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：①預(yù)變性：75℃，120 s；②變性：90℃，5 min；③退火：60℃，60 s；④延伸72℃，30 s；⑤ PCR儀采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)，U6作為內(nèi)參(上游引物為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，MTA1 mRNA(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT表示。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 調(diào)整細(xì)胞濃度，按每孔5×103個(gè)密度鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍(lán)染色，以>30個(gè)細(xì)胞的克隆記為1個(gè)菌落，在顯微鏡下觀察并拍照記錄菌落形成數(shù)量，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 實(shí)驗(yàn)前12 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，將40 μl matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室中，消化細(xì)胞并用1 μl PBS清洗2遍，將500 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基加入24 孔板，取5×105細(xì)胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl 細(xì)胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無(wú)氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng) 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液500 μl進(jìn)行染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察顯穿過(guò)膜的細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，分組處理同上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)液，用10 μlsterile pipette 槍頭沿直線做劃痕，加入100 μl PBS將細(xì)胞碎片沖洗掉，然后無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況以及劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移的距離和細(xì)胞遷移率。

1.8 小管形成測(cè)定 按照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行小管形成實(shí)驗(yàn)，即將50 μl Matrigel水平鋪板至96孔板， 37℃下固化0.5 h。將胰腺癌各細(xì)胞系細(xì)胞(2×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種在基質(zhì)膠上并在含有MTA1 miRNA的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 細(xì)胞在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育16 h，倒置顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.9 Western blotting檢測(cè) 將各組細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/ml，加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清，采用ECA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時(shí)調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入相應(yīng)一抗， 4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 MTA1在EC不同組織和細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，EC組織中MTA1的表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.05)； MTA1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于人正常食管上皮細(xì)胞HFT-1A(P<0.05)，其中在Eca-109細(xì)胞中表達(dá)量最高(P<0.01)。見表1、2。

類別MTA1EC組織0.956±0.537癌旁組織0.119±0.068*

注：與EC組織比較，*P<0.05

細(xì)胞MTA1HET-1A0.915±0.120Eca-1092.227±0.137*SHEEC11.666±0.122*#Ec-97061.712±0.084*#EC87121.407±0.062*#TE-11.366±0.088*#

注：與HET-1A比較，*P<0.05；與Eca-109比較，#P<0.05

2.2 細(xì)胞系構(gòu)建 qRT-PCR結(jié)果顯示，RSK4-MTA1組細(xì)胞中MTA1的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和RSK4-NC組(P<0.05)，空白對(duì)照組和RSK4-NC組MTA1的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別MTA1空白對(duì)照組 1.019±0.054*RSK4-NC組 0.906±0.110*RSK4-MTA1組1.586±0.097

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

2.3 過(guò)表達(dá)MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞株增殖能力的影響 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和RSK4-NC組相比，過(guò)表達(dá)MTA1后，RSK4-MTA1細(xì)胞克隆數(shù)明顯增多(P<0.05)。見表4，圖1。

2.4 過(guò)表達(dá)MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞株侵襲能力的影響 Transwell小室結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和RSK4-NC組相比，過(guò)表達(dá) MTA1后，RSK4-MTA1組Eca-109細(xì)胞通過(guò)matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖2。

表4 MTA1的表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞株增殖能力的影響 個(gè),

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖1 MTA1的表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞株增殖能力的影響(平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖)

表5 MTA1的表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞株的侵襲能力的影響 個(gè),

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖2 MTA1的表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞株的侵襲能力的影響(Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力)

2.5 過(guò)表達(dá)MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞株遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與空白對(duì)照組和RSK4-NC組相比，過(guò)表達(dá)MTA1后，RSK4-MTA1組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6，圖3。

細(xì)胞細(xì)胞遷移率空白對(duì)照組 52.144±4.622*RSK4-NC組 55.534±4.279*RSK4-MTA1組91.499±5.218

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

2.6 MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞株小管形成的影響 評(píng)估MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞血管形成的影響，在空白對(duì)照組和RSK4-NC組中，細(xì)胞不能建立管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，而在RSK4-MTA1組中，16 h內(nèi) MTA1誘導(dǎo)癌細(xì)胞快速形成管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。小管形成測(cè)定的定量分析顯示，與空白對(duì)照組相比， MTA1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中血管的數(shù)量明顯

圖3 MTA1的表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞株遷移能力的影響圖(劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力)增加(P<0.05)。見表7，圖4。

表7 MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞系小管形成的影響 個(gè),

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖4 MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞系小管形成的影響(小管形成的情況)

2.7 過(guò)表達(dá)MTA1對(duì)HIF-α/VEGF通路相關(guān)蛋白HIF-α、VEGF表達(dá)的影響 Western-blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)MTA1對(duì)Eca-109細(xì)胞系中HIF-α/VEGF通路相關(guān)蛋白HIF-α及VEGF的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和RSK4-NC組比較，RSK4-MTA1組HIF-α及VEGF蛋白的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。見表8，圖5。

組別HIF-αVEGF空白對(duì)照組 1.209±0.386*1.064±0.134*RSK4-NC組 0.942±0.222*1.006±0.106*RSK4-MTA1組2.001±0.1872.330±0.391

注：與RSK4-MTA1組比較，*P<0.05

圖5 MTA1與HIF-α/VEGF的作用關(guān)系(Western blotting檢測(cè)HIF-α/VEGF在Eca-109細(xì)胞中的表達(dá))

3 討論

近年來(lái)，由于環(huán)境和日常膳食結(jié)構(gòu)的變化，EC的發(fā)病率和致死率不斷攀升，嚴(yán)重危害人類的健康。目前缺乏根治性治療的外科手段，而EC的靶向治療尚處于起步階段[8]。有研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子調(diào)控或者參與EC細(xì)胞的發(fā)生及癌細(xì)胞的侵襲和遷移，因此從分子基礎(chǔ)生物學(xué)角度出發(fā)尋找EC的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，為患者提供有效的治療方法有著重要的意義[9]。

MTA1是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，其在多種上皮性惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，Toh等[10]從mRNA和蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)MTA1在大腸癌組織中過(guò)表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成明顯正相關(guān)關(guān)系。有報(bào)道MTA1可與Ral-GTPase 結(jié)合激活原癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞癌變的發(fā)生[11]。在對(duì)大量的前列腺癌、大腸癌、乳腺癌的臨床標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)，MTA1 異常表達(dá)所引起的惡性腫瘤占很大比重[12]。另外，Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)MTA1的表達(dá)能明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及對(duì)外遷移。目前尚無(wú)明確的報(bào)道研究MTA1的表達(dá)與EC的侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

本研究采用qRT-PCR檢測(cè)MTA1的mRNA在EC組織和癌旁組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MTA1的mRNA在EC組織中表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)，且在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常是管上皮細(xì)胞(P<0.05)。提示MTA1在EC的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。為觀察MTA1對(duì)食管癌的轉(zhuǎn)移的影響，本研究以EC細(xì)胞系Eca-109作為研究對(duì)象，通過(guò)慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定MTA1過(guò)表達(dá)菌株，結(jié)果顯示RSK4-MTA1組細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。

有研究發(fā)現(xiàn)MTA1能夠促進(jìn)大腸癌旁淋巴管生成，而HIF-1α和 VEGF是腫瘤轉(zhuǎn)移和淋巴管形成的關(guān)鍵蛋白，正常供氧情況下，HIF-1α易被泛素蛋白酶降解，當(dāng)缺氧時(shí)，HIF-1α降解緩慢，蛋白出現(xiàn)增多[14]。文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1α可通過(guò)調(diào)控靶基因來(lái)影響淋巴生成，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[15]，在大腸癌癌、乳腺癌以及口腔鱗狀細(xì)胞癌中已有文獻(xiàn)報(bào)道其能夠促進(jìn)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)淋巴管生成[16]。本研究顯示在空白對(duì)照組和RSK4-NC組中，細(xì)胞不能建立管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，而在RSK4-MTA1組中，16 h內(nèi) MTA1誘導(dǎo)癌細(xì)胞快速形成管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，且與空白對(duì)照組相比， RSK4-MTA1組中血管的數(shù)量明顯增加(P<0.05)。Western-blot檢測(cè)MTA1過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109中HIF-α/VEGF通路相關(guān)蛋白HIF-α及VEGF的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比較，RSK4-MTA1組HIF-α及VEGF蛋白的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，提示MTA1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)HIF-α及VEGF的表達(dá)。

綜上所述，食管癌組織中MTA1的表達(dá)較正常組織明顯增加，MTA1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)食管癌細(xì)胞Eca-109的增殖和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管的形成，MTA1對(duì)食管癌腫瘤進(jìn)展和血管形成可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-α/VEGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。