季銨鹽改性聚偏氟乙烯膜抗污染性能及其對厭氧膜生物反應器微生物的潛在影響研究*

陳 廣 虞雪晴 張厚強 裘 湛 張星冉 王志偉#

(1.上海城投污水處理有限公司，上海 201203；2.同濟大學環境科學與工程學院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092)

厭氧膜生物反應器(AnMBR)是一項結合了厭氧生物處理技術與膜分離技術的污水處理工藝[1]，具有占地面積小、污泥產量低、能耗低等優點。近年來，由于該項工藝具有產生沼氣(甲烷)等優勢而愈發受到關注[2]。然而，膜污染是限制AnMBR廣泛應用的主要因素之一[3-6]。膜污染主要由溶解性有機物(DOM)、膠體物質及顆粒物在膜表面、膜孔內吸附和聚集而引起[7-8]。膜污染可引起跨膜壓差(TMP)的上升，從而降低污水處理效能。生物污染被認為是膜生物反應器(MBR)的重要污染類型[9-11]，主要是由于微生物粘附并在膜面滋生生物膜，導致膜通量下降或者TMP上升[12-13]。

抗菌膜可抑制或延緩膜面的生物污染[14-15]，且不會對成本和膜工藝運行產生顯著影響。因此，開發抗污染膜對膜污染控制具有重要的實踐價值[16],[17]5086。季銨鹽(QAC)是一種殺菌劑，它包含1個中心氮原子和通過共價鍵連接的4個官能團，其中至少有一個長鏈烷基。有關QAC殺菌的機理尚未有完全清晰的解釋，但目前廣泛接受的是QAC通過接觸殺滅產生抗菌效果[18]，即QAC可通過將它們的烷基滲透入微生物的細胞膜，改變磷脂雙分子層，同時破壞膜的完整性，最終導致胞內物質流出[19-20]。因此，可以采用QAC與聚偏氟乙烯(PVDF)膜共混制備QAC/PVDF膜。雖然已有研究表明QAC/PVDF膜在好氧膜生物反應器中應用時具有一定抗污染能力，且對體系內污染物的去除并無明顯不利影響[21]；然而，其在AnMBR中的抗污染性能以及對厭氧微生物活性的影響尚不明確，需進一步探索研究。

本研究采用QAC對PVDF膜改性，探究QAC/PVDF膜在AnMBR中的抗污染性能；將厭氧微生物短期暴露于QAC/PVDF膜的環境中，通過測定其破損細胞比例、厭氧生物處理相關的酶活性(中性蛋白酶和脫氫酶(DHA)活性)、三磷酸腺苷(ATP)及產甲烷性能等，研究QAC/PVDF膜對厭氧微生物的潛在影響，同時考察不同濃度的QAC對微生物活性影響，以分析將QAC/PVDF膜運用于AnMBR的可行性。

1 材料與方法

1.1 QAC/PVDF膜的制備

作為QAC的一種，十二烷基二甲基芐基氯化銨(DDBAC)具有較強的抗菌性和較低的毒性[17]5087，因此選取DDBAC作為抗菌劑，采用相轉化法制備QAC/PVDF膜，所用試劑均為分析純。先將PVDF粉末在 80 ℃ 下 烘 24 h以得到干燥的 PVDF。將 PVDF和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在二甲基亞砜(DMSO)和二甲基乙酰胺(DMAC)混合液中，將以上混合液在80 ℃條件下熟化3～4 d得到均一的溶液a。另取DMSO和DMAC混合液，加入抗菌劑QAC使其充分溶解，得到含有QAC的溶液b。將溶液a用攪拌器攪拌均勻，轉速為800～850 r/min，同時將溶液b逐滴加入到溶液a中，溫度控制為80 ℃，充分攪拌20～24 h，保證混合均勻。室溫下即20～35 ℃真空脫泡30 min，得到均一穩定的鑄膜液。將鑄膜液于室溫下刮制平板膜，在空氣中預蒸發30 s后，浸入凝固浴中，保持24 h固化成形，可得到成形的膜。成形的膜在室溫下用清水沖洗，最終得到改性的QAC/PVDF聚合物分離膜記為MQ，而未經QAC改性的PVDF膜記為MP，膜編號及膜具體組分見表1。

表1 膜材料成分質量分數

1.2 AnMBR的設計

AnMBR裝置如圖1所示，AnMBR在室溫條件下運行，運行溫度為17～28 ℃，將MP和MQ膜組件置于有效體積為1.01 L的AnMBR中，MP和MQ的膜面積均為77.6 cm2。使用N2曝氣以保持反應器內部為厭氧狀態，通過氣體流量計控制曝氣強度，多余的氣體經AnMBR頂部的排放口排出。研究所采用的厭氧污泥取自曲陽污水處理廠穩定運行的AnMBR，污泥質量濃度為8 g/L，7 d更換一次污泥。膜清洗采用離線清洗方法，將膜取出反應器后在0.05%(質量分數)的NaClO中浸泡清洗2 h。通過反應器連續流運行研究QAC/PVDF膜在AnMBR中的膜污染形成過程，并與空白膜進行對比，分析QAC/PVDF膜抗污染行為。

圖1 AnMBR裝置圖Fig.1 Schematic of AnMBR setup

1.3 細胞活性的測定

利用流式細胞儀(BD FACSVerse)測定破損細胞比例[22]，首先將配制的污泥用0.5%(質量分數)的NaCl溶液清洗3次，每次清洗后離心(8 000 r/min，5 min)，過200目篩網，用0.5%(質量分數)的NaCl溶液將污泥稀釋至OD670(670 nm下的吸光度值，其余類推)為0.03后再稀釋100倍，在避光條件下，將染料(L7012 LIVE/DEAD?BacLight Bacterial Viability Kit)與去離子水按1∶1體積比混合后再稀釋10倍，取0.5 mL稀釋污泥于流式細胞管中，加入1 μL染料后在37 ℃搖床以150 r/min轉速暗培養15 min后于流式細胞儀在約480、490 nm處觀察熒光，細胞膜完整的細胞顯綠色熒光，細胞膜殘破的則顯紅色熒光。

采用《蛋白酶制劑》(GB/T 23527—2009)的福林法測定中性蛋白酶，將蛋白酶在堿性條件下用福林試劑還原，生成鉬藍和鎢藍，用分光光度計于波長680 nm下測定溶液的吸光度，酶活性與吸光度成比例，由此可計算酶活性。酶活定義：1 g 揮發性懸浮固體(VSS)酶液在pH=7.0、40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量為一個中性蛋白酶活性單位(U/g)。

使用ATP 試劑盒測定ATP濃度[23]。以8 000 r/min轉速對污泥樣品離心5 min，然后將其重懸于15.4 mmol/L的NaCl溶液中并稀釋 50 倍。取100 μL樣品加入至白色96孔板中，再加入100 μL試劑盒提供的藥劑，混合2 min以裂解細胞，然后靜置10 min以使化學發光信號穩定，最后使用多功能酶標儀(Synergy 4)測定其化學發光強度。

DHA活性的測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法，取0.5 mL污泥用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，在25 ℃下以12 000×g的離心加速度離心10 min，棄上清液，重復3～4次后測定。對照管加0.2 mL Tris-HCl緩沖液，測定管加0.1 mL Tris-HCl緩沖液和0.1 mL TTC-葡萄糖標準溶液，充分混合，在37 ℃暗培養12 h，取出后立即冰浴，加入0.1 mL丙酮，反復振蕩數次，37 ℃保溫10 min，4 ℃下，以12 000 r/min轉速離心5 min，測定485 nm處波長下的吸光度。在37 ℃時，每小時每克VSS樣品使每毫升反應體系OD485每增加0.005定義為一個DHA活性單位(U/g)。在DHA和ATP數據分析中，以DDBAC為0 mg/g的組測得的數據作為100%。

1.4 批次產甲烷實驗設計

取穩定運行的中試AnMBR內污泥，污泥揮發性懸浮固體(MLVSS)/懸浮固體(SS)約為65%(質量分數)，用0.5%(質量分數)NaCl溶液離心清洗污泥，重復3次，洗去污泥混合液中的本底有機物。用DDBAC固體配制DDBAC儲備液(質量濃度為337.50 mg/L)，將儲備液稀釋成不同的濃度后，取相同體積加入到污泥中，配置一系列的DDBAC溶液，分別為0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00 mg/g(以1 g SS中的DDBAC質量計)。由于污泥的緩沖作用，各樣品的 pH 均在7.2左右。

取25 mL配制好的污泥依次加入134 mL的血清瓶中，MLVSS約為5 g/L。加入預先配好的營養鹽(營養鹽配方(除HCl，其余以1 L水中的質量計)：NaHCO35 000 mg、NH4Cl 280 mg、CaCl2·2H2O 10 mg、K2HPO4250 mg、 MgSO4·7H2O 100 mg、酵母膏 100 mg、H3BO30.05 mg、FeCl2·4H2O 2 mg、ZnCl20.05 mg、MnCl2·4H2O 0.05 mg、CuCl2·2H2O 0.03 mg、(NH4)SeO3·5H2O 0.05 mg、AlCl3·6H2O 2 mg、NiCl2·6H2O 0.05 mg、Na2SeO3·5H2O 0.1 mg、乙二胺四乙酸(EDTA) 1 mg、刃天青 0.2 mg、36%(質量分數)HCl 0.001 mL)。實驗以CH3COONa為基質，稱取CH3COONa粉末0.08 g加入血清瓶中。另外，在DDBAC質量濃度為0 mg/g的血清瓶中加入剪取的3.9 cm2MP和MQ以測定產甲烷活性(SMA)和產甲烷潛能(BMP)。用高純N2吹脫5 min后用橡膠塞密封，放置于35 ℃搖床(100 r/min)中培養12 h后，每隔12～24 h測定血清瓶頂空的氣體組分(甲烷和CO2)，連續監測到產氣不再增加為止。測定甲烷和CO2的儀器為氣相色譜儀(GC 6890N-TCD,Agilent)。根據測得的氣體體積作出單位質量VSS產生的甲烷量與對應的時間關系曲線，取前5點作圖，求得斜率即為SMA。

為獲得BMP，采用修正的Gompertz三因素模型擬合實驗得到的甲烷生成曲線[24]。

M(t)=P×exp{-exp[Rmax×e/P×(λ-t)+1]}

(1)

式中：M(t)為累積產生的甲烷量，mL/g；t為反應時間，d；P為最大產甲烷量，mL/g，以1 g VSS產甲烷的體積計，即BMP；Rmax為最大產甲烷速率，mL/(g·d)，以1 d內1 g VSS產甲烷的體積計，即SMA；λ為延滯時間，d。參數P、Rmax、λ采用SigmPlot 12.5進行最小二乘法擬合得到。

1.5 膜面污染物檢測

采用激光共聚焦掃描電鏡(CLSM，Nikon A1)對膜面進行觀察。具體過程為：在膜污染到達終點時(TMP為30 kPa)，將污染膜從膜組件上剪下來(面積為2.25 cm2)。在避光環境中，首先利用 SYPRO Orange(Molecular16 Probes)染色劑對蛋白質染色30 min[25]；再用Concavalin A染色劑對α-多糖染色60 min[26]。用SYTO 9和Propidium Iodide分別對所有的細胞和死細胞染色10 min[27]。每次染色完成后用PBS對樣品清洗3 次去除多余的染色劑。染色完成后，用CLSM對樣品進行觀察。蛋白質在激發波長488 nm、發射波長560 nm下觀察；α-多糖在激發波長 561 nm、發射波長580 nm下觀察。

2 結果與討論

2.1 QAC/PVDF膜的性能

圖2(a)和圖2(b)分別為MP和MQ的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，可以看出MP和MQ表面呈多孔結構，膜表面形貌并無顯著差別。圖2(c)顯示隨著QAC的引入，MQ的平均孔徑較MP的平均孔徑略有增加(分別為(62.43±13.64)、(58.37±9.36) nm)，這是因為QAC 是一種同時具有親水基團和疏水基團的表面活性劑，在成膜過程中可以起到致孔劑的作用，加速了膜孔結構的形成，從而略微增大了膜平均孔徑[28]。圖2(d)表明MQ的孔隙率比MP的孔隙率略有增加。因為QAC作為表面活性劑，可在鑄膜液中包裹水分子，形成穩定的包裹水的反膠束結構(表面活性劑疏水端朝向聚合物，親水端朝向水分子)，該反膠束結構的存在可促進非溶劑向鑄膜液中的擴散，使凝膠速率加快，且表面活性劑形成的反膠束結構可成為致孔劑，促使MQ孔隙略有增加[29]。

圖2 MP和MQ性能Fig.2 Characteristics of MP and MQ

將MP、MQ和對照組(NM，不含膜)浸沒在含有大腸桿菌(Escherichiacoli)的營養肉湯培養基中24 h，圖3(a)為24 h內的OD600，浸有MQ的大腸桿菌菌液24 h內OD600幾乎無變化，穩定在約0.05，而NM和MP的大腸桿菌菌液則在6 h后OD600快速增大，在18 h時達到最大值，最大值大于1.2。圖3(b)為大腸桿菌的對數增長期增長系數，含MQ的培養基對數增長期增長系數接近零，而含MP的培養基及NM的對數增長期增長系數為0.18 h-1。與大腸桿菌菌液接觸24 h后， MP表面粘附較多的大腸桿菌，而MQ膜面很干凈，幾乎無大腸桿菌粘附，通過以上分析可知，QAC的引入使PVDF膜具有抑制大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)生長的特性。

圖3 MP與MQ浸沒于含大腸桿菌的培養基中膜面細菌生長情況Fig.3 Growth situation of bacteria when MP and MQ were immersed in culture medium containing Escherichia coli

選取金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭氏陽性菌的模型細菌，將MP、MQ和NM浸沒在含有金黃色葡萄球菌的營養肉湯培養基中24 h。圖4(a)為24 h內的OD600，浸有MQ的金黃色葡萄球菌菌液24 h內OD600從0.05上升至0.11，上升幅度較小，而NM和MP的金黃色葡萄球菌菌液則在14 h時OD600迅速增大。圖4(b)為金黃色葡萄球菌的對數增長期增長系數，含MQ的培養基對數增長期增長系數為0.03 h-1，而含MP的培養基及NM的對數增長期增長系數約為0.16 h-1。與金黃色葡萄球菌菌液接觸24 h后， MP表面粘附著大量的金黃色葡萄球菌，而MQ膜面幾乎無金黃色葡萄球菌粘附，可知QAC的引入使PVDF膜具有抑制金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)生長的特性。

圖4 MP與MQ浸沒于含金黃色葡萄球菌的培養基中膜面細菌生長情況Fig.4 Growth situation of bacteria when MP and MQ were immersed in culture medium containing Staphylococcus aureus

通過觀測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在含MP和MQ的肉湯培養基中生長情況以及膜面粘附情況，證明未與QAC共混的PVDF膜無抗菌性能，而QAC的引入使MQ具備了抑制細菌生長和粘附的特性，具備了顯著的抗生物污染性能。

2.2 QAC/PVDF膜對AnMBR膜污染的影響

圖5為MP和MQ在AnMBR中的膜污染情況，MQ的3個清洗周期分別是26、28、24 d，MP的3個清洗周期分別為19、18、15 d，MQ的平均清洗周期較MP延長53%，說明將QAC/PVDF膜運用于AnMBR時，QAC/PVDF膜具有良好的抗污染性能，可延緩膜污染的形成，降低膜清洗頻率。MP和MQ最后一個清洗周期較各自的前兩個周期有所縮短，主要原因可能是AnMBR的運行溫度降低。有研究報道溫度的下降會引起膜污染周期的下降[30]，因為在較低溫度下，混合液污泥黏度較大，容易沉積在膜面，從而促使TMP增大[31]。從圖5可看出，即使在低溫條件下，相較于MP，MQ仍然呈現出抗污染性能。

圖5 不同運行時間MP和MQ的TMP和溫度Fig.5 Variations of TMP and temperature for MP and MQ with time

胞外聚合物(EPS)中多糖具有較高的分子量和更廣泛的分子量分布，多糖被認為是EPS中重要組成物質[32]，多糖在MP膜面的沉積顯著多于MQ，而在錯流過濾中，多糖在膜面的沉積會引起過濾通量的下降，進而引起過濾性能和膜性能的下降[33]，CLSM分析表明，在連續流過濾中QAC/ PVDF膜可減少α-多糖在膜面的聚集，從而延緩膜污染。與此同時，連續流實驗后MP膜面的活細胞較多，而MQ膜面則死細胞較多，說明在錯流中，QAC/PVDF膜可引起細菌在膜面附近的生長抑制和細胞死亡[17]5091。

2.3 QAC/PVDF膜對厭氧微生物的急性影響

QAC/PVDF膜對AnMBR厭氧微生物的急性影響如圖6所示。由圖6(a)可以看出，與MP和MQ接觸2 h，破損細胞比例幾乎與空白組(不含MP或MQ，即為DDBAC為0 mg/g的組)相同。然而，隨著游離態DDBAC濃度上升，破損細胞比例由初始的14.4%增大至38.7%，當DDBAC質量濃度低于2.00 mg/g時，破損細胞比例低于22%。而隨著DDBAC質量濃度增大至5.00 mg/g，破損細胞比例增大至近40%。有研究表明QAC分子可通過滲透擴散進入細胞膜而使細胞受到破壞[34]，QAC對于細菌細胞壁具有裂解作用[35]。本實驗表明厭氧微生物與QAC/PVDF膜的短暫接觸(2 h)并不會對微生物細胞造成明顯破損，但游離態DDBAC可引起厭氧微生物細胞的破損，其濃度越高對細胞完整性的破壞越強。

圖6(b)表明與MQ接觸2 h后，厭氧微生物的中性蛋白酶活性與空白組接近，未發生明顯變化。當DDBAC質量濃度增大至2.00 mg/g時，中性蛋白酶活性降至低至空白組的約50%，DDBAC進一步增加至3.00 mg/g，中性蛋白酶活性驟降至接近零，即高于3.00 mg/g的DDBAC會使中性蛋白酶失活；而MQ的存在并不會明顯影響厭氧微生物的中性蛋白酶活力，中性蛋白酶參與蛋白質的水解[36-37]，游離態QAC濃度上升可引起細胞蛋白質水解功能下降，而MQ對其幾乎無影響。

注：橫坐標中MP、MQ是指分別加入MP、MQ膜，其余數值為各組中分別加入的游離態DDBAC質量濃度，圖7同。圖6 不同DDBAC質量濃度下的細胞破損比例及酶活性Fig.6 Ratio of broken cells and activities of enzymes under various DDBAC concentrations

DHA活性變化如圖6(c)所示，與MQ接觸后厭氧微生物DHA活性與空白組接近。但0.50 mg/g的DDBAC即可引起DHA活性減小，約為空白的80%，1.00 mg/g時DHA與0.50 mg/g時相近，但隨著DDBAC濃度繼續升高，DHA活性下降至原來的60%以下，在5.00 mg/g時DHA活性僅為空白的24.7%。在較低質量濃度(1.00 mg/g以下)下，DHA活性相對較高，但質量濃度高于1.00 mg/g時，DHA活性下降較為劇烈。類似地，MQ的存在并不會明顯影響微生物的DHA活性。

ATP是微生物代謝重要的能量物質，圖6(d)表明ATP隨著DDBAC濃度增大而下降，在1.00 mg/g以下時的ATP可達空白的80%以上，但當質量濃度高于1.00 mg/g時，ATP明顯呈下降趨勢，在5.00 mg/g時僅為空白的27%。同樣，MQ的存在并不會影響微生物ATP的產生，然而游離態QAC濃度的升高可引起厭氧微生物代謝活性下降。

2.4 QAC/PVDF膜對厭氧微生物產甲烷性能的影響

進一步考察了MQ暴露條件下的SMA和BMP的變化情況，如圖7所示，DDBAC質量濃度在0.25 mg/g以下時，SMA和BMP幾乎沒有減小，隨著DDBAC質量濃度上升至2.00 mg/g，厭氧污泥的SMA和BMP呈線性下降趨勢，分別由(53.42±3.13) mL/(g·d)和(265.33±3.85) mL/g下降為(2.52±0.79) mL/(g·d)和(15.86±3.93) mL/g。BMP與SMA變化趨勢較為一致，而厭氧微生物破損細胞比例(見圖6(a))隨DDBAC濃度增大而呈增大趨勢，SMA和BMP下降及破損細胞比增高共同表明，隨著DDBAC濃度增大，DDBAC對厭氧微生物細胞活性的破壞越來越強，濃度的增大可引起細胞失活。此外，與MP和MQ接觸的厭氧微生物的SMA和BMP與空白組接近，說明雖然游離態QAC會因濃度不同而對微生物產甲烷能力產生不程度的負面影響，但QAC/PVDF膜并不會對厭氧微生物產甲烷能力產生明顯不利影響。

圖7 不同DDBAC質量濃度下的SMA和BMPFig.7 SMA and BMP under various DDBAC mass concentrations

3 結 論

(1) 將MP和MQ運用于AnMBR，對比發現QAC/PVDF膜的平均清洗周期較未改性的空白膜長 53%，可以延緩AnMBR膜污染的形成。

(2) 通過對連續流膜面污染物分析，發現QAC/PVDF膜膜面有機物含量和活細菌含量較低，即在AnMBR運行時，QAC/PVDF膜可提高AnMBR運行時膜對有機物和微生物粘附的抵抗性能。

(3) 將厭氧微生物與MQ接觸并沒有對細胞完整性、DHA活性和ATP等產生明顯影響，說明QAC/PVDF膜并無明顯生物毒性；而游離態QAC會對細胞完整性、DHA和ATP產生不利影響。

(4) 厭氧微生物與MQ 接觸后，厭氧微生物破損細胞比例、中性蛋白酶活性、DHA活性及產甲烷能力(SMA和BMP)與空白組相近，表明QAC/PVDF膜并不會對厭氧微生物細胞活性及產甲烷能力產生明顯不利影響；而游離態QAC會對SMA和BMP產生不利影響。