山蒼子果實發育及內含物、精油的變化規律

藍公毅，陳景震，馬英姿，劉 熙，周詩雨

（1.中南林業科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業科學院，湖南 長沙 410004）

山蒼子Litsea cubeba又名山雞椒、木姜子等，為樟科落葉灌木或小喬木，在我國分布于長江以南，廣西、廣東、湖南、貴州、四川等省區，以野生為主，生長于低山丘陵地區[1]。山蒼子果實、花、葉、根都是提取山蒼子油的原料，果實含油率最高[2-5]，其精油中的主要成分是檸檬醛，為制造紫羅蘭酮系列香料的重要原料。目前山蒼子精油在食品、醫藥、農藥、洗滌、化妝品等領域均有廣泛應用[6-15]。

近年來植物精油的醫學作用逐漸成為研究熱點，劉威等[16]研究發現，臭冷杉精油具有顯著抗炎作用，能夠有效鎮咳、祛痰，并且對乙酰膽堿和磷酸組胺噴霧引起的豚鼠哮喘有明顯抑制作用；權美平等[17]研究發現，茜草精油對四氯化碳導致的肝損傷有保肝作用；扶巧梅等[18]研究發現，雪松葉精油和馬尾松葉精油對白紋伊蚊和致倦庫蚊有較強的毒殺活性；有研究表明山蒼子精油具有祛風散寒、理氣止痛、健胃消食等功效[19]， 臨床用精油治療慢性氣管炎，支氣管哮喘，冠心病及心絞痛等[20-22]；山蒼子精油還可用于降解致癌物質黃曲霉素，對于糧食污染有奇特功效[23]， 同時，山蒼子精油對副溶血性弧菌菌Vibrio parahaemolyticus、李斯特菌Listeria monocytogenes和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum有著顯著的抑制作用[24]，可以抑制菌絲生長并且改變其超微結構，被認為是一種安全的天然植物保護劑。

目前國際市場的山蒼子油價格持續升高，在2008年底，檸檬醛含量達到70%以上的山蒼子精油價格可達1.0×105元·t-1，而我國年產的山蒼子油有20 000 t 以上，是世界上最大的山蒼子油生產國和出口國，年出口量達3 500 t，產品遠銷海 外[26-28]，另一方面，我國山蒼子產量雖高，但生產水平偏低，出口以初級原油為主，無法將我國山蒼子資源優勢利用充分。本研究對山蒼子果實的生長發育動態、內含物含量、精油含量、精油組分進行了研究，旨在為山蒼子果實精油的更好利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試 劑

蔗糖、蒽酮、乙酸乙酯、98% 濃硫酸、80%Ca(NO3)2、NI2-NI、100 μg·mL-1標準蛋白溶液、考馬斯亮藍G-250、正己烷、氫氧化鈉、甲醇、無水硫酸鈉均為分析純。

1.2 材 料

試驗材料采集于湖南省林科院試驗林場，選擇生長良好的植株，從果實形成（4月31 日）開始，在5—9月，共計110 d，采用隨機取樣法，每7 ～ 10 d 采樣一次，每次采果實100 粒，采后立即置入保鮮袋帶回實驗室，儲存在-4 ℃冰箱中備用。

1.3 方 法

1.3.1 果實生長變化的測量

在不同時間隨機選取發育正常的山蒼子果實20 顆，用電子數顯游標卡尺測量其橫、縱徑，記錄測量結果；用電子天平測定百粒果實的鮮質量（精確度1/1 000）。

1.3.2 果實內含物含量測定

果實可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法；蛋白質含量測定采取考馬斯亮藍G-250 法；淀粉含量測定參考苗紅霞[29]的試驗方法，對山蒼子果實中淀粉總含量進行測定，將山蒼子果實浸入0.5%的亞硫酸氫鈉溶液中護色10 min，于40 ℃干燥20 ～24 h，磨粉，水洗后進行離心，其殘渣用 5 mL 80%Ca(NO3)2懸浮，沸水浴提取10 min，在4 000 r·min-1下離心4 min，將上清液轉入20 mL 容量瓶，殘渣用80%Ca(NO3)2重復提取2 次，用提取液定容至20 mL，實驗設3 次重復，顯色方法參考徐昌杰等[30]的報道。取樣品1 mL，用80%Ca(NO3)2補充至2 mL,加入100 μL NI2-NI，搖勻，在620 nm 波長下測定吸光度，計算樣品中淀粉含量。

1.3.3 果實精油含量測定

自5月開始，每月從山蒼子植株上采集鮮果，取粉碎后的果實100 g，置于旋轉蒸發器中，采用水蒸餾法提取精油，計算精油含量。

1.3.4 精油組分測定

精油甲酯化：取50 μL 油樣置于試管，加入4 mL 正己烷溶解油樣，再加2 mL NaOH-甲醇溶液，震蕩，在50 ℃水浴鍋中水浴10 min，加2 mL 蒸餾水，搖勻后取上清液置于離心管，加入無水Na2SO4，移50 μL 置于浸樣瓶，加入正己烷待測。

采用氣相色譜法測定，色譜柱為FFAP 型，石英玻璃毛細管柱（0.3 mm×25 m），升溫程序：柱溫從40 ℃保持1 min、以20 ℃·min-1的速度升溫至100 ℃，保持2 min；再以20 ℃·min-1升溫至 220 ℃，保持2 min；最后以20 ℃·min-1升溫至 280 ℃，保持5 min。色譜參數：載氣為高純度氦，總流速40 mL·min-1，柱內流速1.1 mL·min-1，進樣口溫度250 ℃，進樣量1 μL。GC 和MS 接口溫度270 ℃，質譜條件：電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描質量范圍（m/z）15 ～ 500 amu。色譜圖結果按照峰面積歸一法計算。

1.4 數據處理

運用SPSS17.0 軟件進行數據統計與分析，運用OriginPro2017 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 山蒼子果實發育的動態變化

2.1.1 山蒼子果實的外部形態變化

山蒼子果實的橫、縱經在生長發育過程中呈現為較明顯的“S”型曲線趨勢（圖1）。不同生長時期果實的橫徑與縱徑生長變化的趨勢相對一致，其具體生長過程可劃分為3 個時期：1 ～25 d，幼果的橫縱徑快速增長，是果實發育全時段中生長最迅速的時期，果實橫、縱徑分別增長2.41、1.78 mm，縱徑生長量達到了果徑增長總量的45%左右，果皮呈翠綠色；25 ～80 d， 果實增長速度趨于平緩，橫、縱經分別增長1.61、1.78 mm，此階段的增長量為果徑總增長量的35%左右，這一階段果實表皮上開始出現白色斑點，綠色逐漸加深；80 ～110 d，果實生長的第二次高峰期，橫、縱徑分別增長0.88、 0.76 mm，橫縱徑增長量達到果徑總增長量的20%左右，在這一階段的后期，果實開始變黑，步入成熟期，增長速度減緩，最終停止增長。橫縱徑的變化幅度在發育過程中基本保持同步變化。

進入9月以后，在果實發育的110 ～130 d，山蒼子果實失水皺縮，果徑開始迅速下降，果實橫徑下降1.43 mm，縱徑下降1.32 mm，分別占完熟期果實橫、縱徑的20.4%和18.1%。

圖1 山蒼子果實形態動態變化Fig.1 Dynamic change of fruit morphology in L.cubeba

2.1.2 山蒼子果實的質量增長變化

山蒼子果實千粒質量的增長動態也呈現出較為明顯的“S”型曲線生長趨勢（圖2）。但生長趨勢與果實橫、縱徑的生長變化相反，其生長同樣可以劃分為3 個時期：1 ～40 d，果實千粒質量增長較為緩慢，此階段果實千粒質量增長46.2 g，增長量達到增長總量的33%左右；40 ～80 d 果實發育較為迅速，果實千粒質量增長72.2 g，增長量達到增長總量的52%左右；80 ～110 d，果實發育速度再次變得緩慢，在此階段中，千粒質量增長量為20.5 g，達到增長總量的15%左右。

進入9月以后，在果實發育的110 ～130 d，山蒼子果實失水皺縮，果實千粒質量開始迅速下降，千粒質量下降22.8 g，占完熟期果實千粒質量的14.3%。

圖2 山蒼子果實千粒質量動態變化Fig.2 Dynamic change of 1 000-fruit mass in L.cubeba

以果實發育時間作為自變量，果實橫縱經、千粒質量分別作為因變量求得相關系數R2 （R2橫徑=0.912，R2縱徑=0.935，R2千粒質量=0.834），可以看出，山蒼子果實的發育形態與果實發育的時間高度相關。

2.2 果實內含物含量的變化

2.2.1 果實發育過程中可溶性糖含量變化

果實可溶性糖含量在發育前期呈現下降趨勢（圖3），在14.0 ～8.9 mg·g-1之間，隨后在發育中期回升至初期水平，在8.9 ～11.9 mg·g-1，在發育后期趨于穩定略有上升，在11.9 ～14.8 mg·g-1之間，完熟期達到峰值，在果實完全成熟后含量因自身消耗開始下降。

2.2.2 果實發育過程中淀粉含量變化

果實淀粉含量與可溶性糖含量變化方式相似，在發育前期呈現下降趨勢，在13.6 ～8.0 mg·g-1之間，中期開始回升，在8.0 ～10.4 mg·g-1之間， 后期趨于穩定且有緩慢上升，在10.4 ～12.9 mg·g-1之間，果實完全成熟后含量開始下降。

2.2.3 果實發育過程中可溶性蛋白含量變化

果實的可溶性蛋白含量在發育前期迅速增加，隨后又下降至初期水平，在13.5 ～13.4 mg·g-1， 其中最高達到17.0 mg·g-1，中期開始下降，在13.4 ～10.1 mg·g-1，發育后期迅速上升10.1 ～ 26.2 mg·g-1，完熟期達到峰值，隨后因果實自身消 耗，含量開始迅速下降。

2.3 山蒼子果實形態變化與內含物含量變化的相關性

山蒼子果實內含物積累與外部形態發育及精油積累相關性分析（表1）顯示：在山蒼子果實發育過程中，可溶性糖和淀粉與果實外部形態變化及精油積累不具備明顯相關性，而蛋白質含量則具有明顯的相關性，蛋白質含量與果實干質量（r=0.778）和果實精油含量（r=0.728）存在相關性，可見，山蒼子果實蛋白質的含量在果實發育過程中伴隨果實質量和精油含量的升高，呈明顯上升趨勢。山蒼子在發育過程90 ～110 d 時，淀粉和可溶性糖含量沒有出現明顯變化，蛋白質含量則顯著下降，此階段為山蒼子果實精油迅速積累期，推測可能是蛋白質在此階段大量轉化為油脂導致。

圖3 山蒼子果實的內含物含量變化Fig.3 Changes of inclusion contents in L.cubeba fruit

表1 果實內含物含量與外部形態及精油積累相關性分析Ta ble 1 Analysis of correlation of contents of inclusions in fruit with external morphology and accumulation of essential oil

2.4 果實精油含量的變化

采用水蒸餾法，測得山蒼子果實的精油含量從5—9月分別為1.89%、2.96%、4.02%、4.97%、3.64%。在果實發育初期，采用常規方法檢測不到果實精油的存在。

從5月份開始，果實質量體積方面的增長處在相對緩慢的階段，在此時，精油含量快速增長，即果實正在快速積累油脂，并在8月達到最高，為4.97%。

8月下旬果實完全成熟，大小形態幾乎不再變化，顏色由綠色開始變黑，逐漸開始失水變小，9月精油含量已經降低至3.64%。表明在8月中旬果實成熟時，可以開始采收。

2.5 不同時期山蒼子果實精油成分的變化

經過對山蒼子果實精油的分析鑒定，共檢測出20 種成分（表2），其中5—9月分別檢測出19、20、20、17、16 種。

表2 5—9月山蒼子果實精油化學成分及含量?Table 2 Chemical components and their contents in L.cubeba essential oil from May to September

山蒼子果實在發育過程中的主要成分為D-檸檬烯、桉葉油醇、馬鞭草烯醇、橙花醛、香葉醛，其變化規律如圖4 所示。隨著果實發育成熟，檸檬醛的兩種異構體橙花醛和香葉醛的含量有明顯升高，在5月含量分別為12.05%、17.44%，到9月果實完全成熟后含量分別達到31.14%、40.49%，成為果實精油中含量最多的成分；D-檸檬烯的含量隨著果實發育，則呈現明顯的下降趨勢，在5月，含量高達39.92%，是此時果實中含量最高的成分，在9月其含量已下降至2.31%；桉葉油醇在5月含量為11.40%，在9月含量僅存0.73%；馬鞭草烯醇在果實發育過中較平穩，僅在6月上升至14.13%，其余月份基本保持穩定，果實完全成熟時含量為8.60%。研究中發現，在7—8月，即果實發育的90 ～120 d，各主要組分含量無論處于上升還是下降趨勢，在此時期都保持較穩定水平，其具體機制有待進一步研究。最重要的有效成分檸檬醛在果實成熟后含量仍然有提升，但受限于果實在發育150 d 時已完全成熟，其后精油含量明顯下降的原因，可確定最佳的采收日期為8月下旬。

圖4 山蒼子果實精油主要成分動態變化Fig.4 Dynamic changes of main components in L.cubeba fruit essential oil

在其它組分中，隨著果實發育，含量有明顯上升趨勢的組分有雙戊烯、2,4-二甲基庚烷、4-甲基辛烷、香茅醇、α-蒈烯、庚三醇（在5月份尚未檢測出該組分）；含量有明顯下降趨勢的組分有α-松油醇、香葉醇（8、9月已檢測不到該組分）、α-水芹烯（8、9月已檢測不到該組分）、芳樟醇、1,3,8-孟三烯（在8、9月已檢測不到該組分）； 7月含量達到最高值的組分有：月桂烯、甲基庚烯酮、反石竹烯。

2.6 山蒼子果實形態變化與精油成分變化的相關性

山蒼子果實外部形態變化與精油主要成分變化相關性分析（表3）顯示：除馬鞭草烯醇外，其它的主要組分與外部形態存在顯著的相關性。D-檸檬烯與果實千粒質量（r=-0.903**）呈極顯著負相關，與果實大小（與橫徑r=-0.801*，與縱徑r= -0.816*）呈顯著負相關；桉葉油醇與果實千粒質量（r=-0.948**）呈極顯著負相關，與果實大小（與橫徑r=-0.881*，與縱徑r=-0.894*）呈顯著負相關；橙花醛與果實千粒質量（r=0.880*）呈顯著正相關，與果實大小（與橫徑r=0.784，與縱徑r=0.794）呈顯著正相關；香葉醛與果實千粒質量（r=0.830*）呈顯著正相關，與果實大小（與橫徑r=0.739，與縱徑r=0.741）呈顯著正相關，表明隨著果實發育成熟，D-檸檬烯和桉葉油醇含量減少，橙花醛和香葉醛含量升高。

在精油含量方面，精油含量與果實千粒質量（r=0.961**）呈極顯著正相關，與果實大小（與橫徑r=0.966**，與縱徑r=0.977**）同樣呈極顯著正相關，表明果實生長過程中外部形態指標與精油含量有非常明顯的關聯，其中關聯系數最大的是果實縱徑，表明果實縱徑基本可以指示果實精油含量的變化。

綜上所述，經過對果實外部形態與精油含量及成分的相關性分析，發現果實外部形態與精油含量都具有一定的相關性，其中與精油積累關聯最大的是千粒質量，則表明千粒質量基本可以指示果實精油含量及成分的變化，可以此對發育中的果實精油積累情況進行監測，確定果實的發育狀況，制定合理的采收時間。

表3 山蒼子果實精油與外部形態相關性分析?Table 3 Correlation analysis between components in essential oil and external morphology in L.cubeba fruit

3 結論與討論

山蒼子果實發育從花后10 d 開始，具體時間為4月中下旬至9月上旬，持續時間110 d，根據果實發育的外部形態特點，可以將果實發育劃分為3 個時期：果實快速生長期（花后10 ～35 d）， 果實緩慢生長期（花后35 ～90 d），果實顏色變化期（花后90 ～130 d）。果實可溶性糖及淀粉的含量經過發育初期的下降逐漸回升到初始濃度水平，可溶性糖含量在花后105 d 時達到最高，為14.77 mg·g-1，淀粉含量在花后105 d 達到最高，為12.87 mg·g-1，蛋白質含量此時同樣達到最高值26.81 mg·g-1，表明果實內含物合成的高峰期主要集中在花后50 ～100 d 之間，即6月下旬到8月上旬之間。在這一階段中，果實含水率下降迅速，這可能是由于果實發育過程中，內含物及精油的不斷積累導致含水率不斷下降，這與湯佳[31]、鄭德勇[32]的研究結果一致。能夠引起果實膨大、鮮質量增高的原因主要分為果實細胞數量增加、果實細胞體積增大、果實細胞的間隙增大[33]。在本研究中，花后約90 d 之后，可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白3 種內含物含量均出現下降，此時果實的橫縱經、千粒質量處在增加的末期，在此階段之后，外部形態指標開始降低，表明在果實膨大、鮮質量增高的階段需要充分的營養供應，推測花后約90 d 內含物含量下降是由于果實膨大消耗養分導致。在果實進入顏色變化期后，果實精油含量則迅速積累，蛋白質含量則明顯下降，根據內含物含量與精油含量的相關性分析，蛋白質可能在此階段大量轉化為油脂，其具體轉化機制目前有待進一步研究。

在果實精油含量方面，可以發現山蒼子果實的精油含量隨著發育時間的增長呈現線性增長，但在果實發育成熟后精油開始揮發，總含量下降；5—9月精油中共檢測出20 種成分，其中5—9月分別檢測出19、20、20、17、16 種，5—9月均有出現的成分有15 種，精油中的主要成分為：D-檸檬烯、桉葉油醇、馬鞭草烯醇、橙花醛、香葉醛。D-檸檬烯及桉葉油醇含量伴隨果實發育明顯下降，橙花醛及香葉醛含量則顯著上升，馬鞭草烯醇含量變化則沒有明顯規律，含量保持相對穩定。根據果實外部形態變化與精油主要成分變化相關性分析，精油含量與果實千粒質量呈極顯著正相關，與果實大小同樣呈極顯著正相關，表明果實生長過程中外部形態指標與精油含量有非常明顯的關聯。在精油的主要成分中，除馬鞭草烯醇外，其它的主要組分與外部形態存在顯著的相關性。D-檸檬烯與果實千粒質量呈極顯著負相關，與果實大小呈顯著負相關；桉葉油醇與果實千粒質量呈極顯著負相關，與果實大小呈顯著負相關；橙花醛與果實千粒質量呈極顯著正相關，與果實大小呈顯著正相關；香葉醛與果實千粒質量呈顯著正相關。在發育過程中，D-檸檬烯含量迅速下降，檸檬醛含量迅速上升，可見在發育過程中D-檸檬烯會轉化為檸檬醛，其具體轉化機制有待進一步研究。在精油的主要成分中，D-檸檬烯含量隨著果實發育明顯下降，在5月含量可達總量的40%，D-檸檬烯具有消炎、減痛、抑菌、治療癌癥的作用[34-35]， 如需要提取檸檬烯，可在果實發育初期，即5月14、15 日采收果實。桉葉油醇在5月份含量11.40%，隨著發育時間迅速下降，9月含量僅存0.73%，桉葉油醇在臨床醫學上用于與樟腦組成配方治療頭痛，如需提取桉葉油醇同樣可在果實發育初期，即5月14、15 日采收果實。最主要的有效成分檸檬醛（橙花醛+香葉醛）在果實發育初期含量為29.49%（12.05%+17.44%），發育至8月中旬時含量可達57.38%（25.26%+31.82%），9月中旬時含量可達71.63%（31.14%+40.49%），但受限于果實精油總含量在8 中旬后由于完全成熟已經開始明顯揮發下降，可確定為獲取檸檬醛采收山蒼子果實的最佳時期為8月下旬。