SRB分離鑒定及處理冶金酸性廢水中鉻的實驗研究

張 穎，李喜林，李致格，張富隆

(1.滁州學院 土木與建筑工程學院，安徽 滁州 239000；2.遼寧工程技術大學 土木工程學院，遼寧 阜新 123000；3.北京世源希達工程技術有限公司，北京 100080)

冶金行業的不斷發展導致冶金的生產流程較復雜，產生的廢水所含污染物越來越多[1]，如：軋鋼等金屬加工過程會產生大量的酸性廢水，包括廢酸和工件沖洗水。金屬中摻加鉻會提高金屬的機械性能，這導致冶金行業中會有大量的鉻流失。自然界中，鉻以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的形式存在[2，3]，其中Cr(Ⅵ)是一種毒性很大的致突、致癌劑，通常認為其毒性要比Cr(Ⅲ)的高100倍[4]。硫酸鹽還原菌(SRB)由于其具有處理費用低、處理污染物種類多等優點而得到了廣泛的應用[5,6]，主要通過還原SO42-消耗水合氫離子、還原生成的S2-與重金屬離子結合生成溶解度小的金屬硫化物沉淀而使水質得到改善[7-9]。Wosiack[10]等人研究表明，SRB在厭氧條件下能有效還原廢水中的SO42-，且能使金屬離子達到有效去除。張鴻郭[11]等人研究表明固定化的硫酸鹽還原菌對廢水中Cr(VI)和SO42-的去除率分別為97.43%和99.30%。目前，國內外研究者已將其廣泛應用在處理含重金屬離子的工業廢水、有機廢水、城市生活廢水、酸性地浸礦山地下水、酸性礦山廢水等方面[12-14]。基于此，本實驗從污水處理廠生化池中取得種樣，通過對培養條件的優化，獲得可以同時有效去除冶金廢水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的厭氧優勢菌屬。

與一般的回歸分析一樣，二次回歸正交設計預測值的方差隨試驗點在因子空間的位置不同(各因素所取水平不同)而呈現較大差異[15]，因而導致設計不能在各個方向均提供等精度的估計，于是不能對不同試驗點預測值進行直接比較。由于誤差的干擾，就不易根據預測值尋找最優區域[16]。為了克服這個缺點，本研究采用回歸旋轉設計。回歸旋轉設計，一方面，基本保持了回歸正交設計優點，即實驗次數少、計算簡便，且部分地消除了回歸系數間的相關性[17]；另一方面，能使二次回歸設計具有旋轉性。利用具有旋轉性的回歸方程進行預測時，對于同一球面上的點可直接比較其預測值的好壞，從而易于找出預測值較優區域[18]。

綜上所述，實驗選用阜新市皮革園區生化池獲得的液體菌種作為SRB的篩選樣品，基于微生物的分離鑒定及其特性研究手段，獲得優勢SRB菌株進而研究不同反應條件下SRB對廢水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果，并通過回歸旋轉實驗進一步確定最優實驗條件。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

菌株篩選樣品取自阜新市皮革園區生化池。實驗所用的KNO3、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaSO4·2H2O、檸檬酸鈉、結晶紫、草酸銨、碘化鉀、孔雀綠、番紅、乙醇、重鉻酸鉀、硝酸鉻高錳酸鉀等均為分析純。

實驗儀器：YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌鍋、HPS-280型生化培養箱、VD-650型超凈工作臺、XS-212型光學顯微鏡、pHS-3C型精密pH計、TG-328A型電子天平、UV756PC型721分光光度計。

富集培養基的配置：KNO31 g/L，Na2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 0.5 g/L，CaSO4·2H2O 0.5 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏1 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，蒸餾水1 L，pH=8，121℃滅菌20 min。固體培養基：在富集培養基中加入2%的瓊脂。121℃滅菌20 min。

模擬冶金酸性廢水的配置：Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的濃度分別為50 mg/L、10 mg/L、500 mg/L，溶液pH=5。

1.2 實驗方法

1.2.1 水質指標測定方法

利用二苯碳酰二肼分光光度法測定Cr(VI)。高錳酸鉀氧化-二苯碳酰二肼分光光度法測定Cr(Ⅲ)。鉻酸鋇分光光度法測定SO42-，玻璃電極法測定pH。

1.2.2 菌株馴化、篩選和分類方法

對菌株進行耐鉻能力馴化，使菌株能夠在含有Cr(VI)和Cr(Ⅲ)的廢水中生長。最初階段先加入濃度為10 mg/L的Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)，使細菌逐漸適應生長環境，一周后加大Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)投加量，以后每周依次加入50、80、120、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L，使其能夠逐漸適應高濃度的環境；稀釋涂布-疊皿夾層法對SRB純化分離；鏡檢法對SRB進行鑒定。

1.2.3 SRB處理廢水的方法

取6份200 mL配置好的含Cr(VI)50 mg/L、Cr(Ⅲ)10 mg/L、SO42-500 mg/L的水樣，調節pH=7，分別加入不同體積比的處于對數期的經過馴化、分離SRB(細菌計數得到菌液對數期的菌密度為3×108個/mL)，置于35℃厭氧培養箱中充分反應24 h后，將其置于離心機轉速為4000 r/min條件下，離心處理30 min，取上清液測定Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-濃度，并計算其去除率，確定最佳SRB投加量。以同樣的方法分別控制不同pH、反應時間、反應溫度，測定Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-濃度，確定最佳反應pH、時間和溫度。

1.2.4 去除率的計算方法

按照上述方法測定在不同SRB投加量、反應時間、反應溫度條件下，處理后的冶金廢水中Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的濃度，并通過式(1)計算出各個污染物的去除率。

(1)

式中：y：去除率，100%；

c1：處理前污染離子的濃度，mg/L；

c2：處理后污染離子的濃度，mg/L。

1.2.5 正交旋轉組合設計方法

選取SRB投加量、反應時間、反應溫度3因素，展開3因素正交旋轉組合設計，對SRB處理酸性冶金廢水中鉻的效果進行優化，對因素水平進行編碼，結果見表1所示。

表1 實驗的因素水平編碼表

*Z1SRB投加量；Z2反應時間；Z3反應溫度

2 結果與分析

2.1 SRB分離純化及馴化鑒定結果

采用疊皿-夾層培養法對馴化后的耐鉻細菌進行純化分離，在35 ℃的培養箱中培養3 d時菌落形態如圖1所示。這是因為硫酸鹽還原菌代謝產生的H2S與培養基中的Fe2+反應生成黑色FeS沉淀所致[19]。選取形態單一的菌落置于滅菌消毒處理后的培養基中富集培養5 d后，溶液變為墨汁色，并產生大量的臭雞蛋氣味的氣體，說明SRB已經適應環境，能夠在500 mg/L的高濃度含鉻廢水中存活。

圖1 細菌的富集培養圖

在1600倍油鏡下鏡檢革蘭氏染色和經番紅復染的芽孢染色的結果分別如圖2a、2b所示，結果發現SRB均被染為紅色，所以初步判斷該菌屬無芽孢、呈陰性；在1600倍的油鏡下觀察到的細菌的鞭毛染色結果由圖3a所示，可知菌株是極生鞭毛；純化后的SRB透射電鏡放大30000倍的檢測結果如圖3b所示，可明顯看出該菌株呈桿狀，且具有鞭毛。

a.革蘭氏染色圖 b.芽孢染色圖

圖2細菌染色結果圖

a.鞭毛染色圖 b.透射電鏡檢測圖

圖3細菌鏡檢結果圖

分別將菌株在好氧和厭氧條件下培養3 d后進行基因測序，得到兩種條件下培養菌株的DNA測序結果相同，說明培養的菌株屬于兼性厭氧菌。通過對該菌株的基因測序以及通過BLAST基因庫比對、序列同源性分析可看出，該兼性厭氧菌與Citrobacter amalonaticus TB10的相似性最高，相似度達99.93%，說明該菌株與Citrobacter amalonaticus TB10屬于同一性質的菌株，均為檸檬酸性桿菌。并利用MEGA 6.0軟件得到所測菌株序列與其他物質的親緣關系，得到的進化樹結果如圖4所示。

圖4 菌株的系統進化樹

2.2 SRB對冶金酸性廢水去除效果

2.2.1 SRB投加量對污染物去除率的影響

不同體積比的SRB條件下對Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖5所示。可看出，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率均隨著SRB投加量的增加逐漸增大，在SRB投加體積比為1.5%時，Cr(Ⅲ)的去除率較低為9.5%，Cr(VI)的去除率較高為67.8%，這是由于SRB將溶液中的Cr(VI)還原為大量的Cr(Ⅲ)，使溶液中Cr(Ⅲ)的濃度增大，而當SRB菌足夠多為3%時，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分別為95.8%、68.7%、70.8%，這是因為SRB將溶液中的Cr(VI)還原Cr(Ⅲ)，將SO42-還原為S2-，S2-與Cr(Ⅲ)發生雙水解反應，生成Cr(OH)3沉淀，使得Cr(Ⅲ)的濃度降低。當SRB投加量繼續增大時，去除率增加不明顯，綜合考慮確定最佳的投加量為3%。

圖5 SRB投加量對污染物的去除影響

2.2.2 初始pH對污染物去除率的影響

不同pH條件下對Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖6所示。可看出，隨著pH的逐漸增大，Cr(Ⅲ)的去除率逐漸增大，而Cr(VI)、SO42-的去除率在pH>7時逐漸下降，在pH=7時去除率最大，分別為95.8%、70.8%，說明SRB為中性菌，在pH值為7時活性最好；Cr(Ⅲ)隨著pH增大一直呈現上升趨勢，且在pH>7時上升的更快，這是因為pH>7溶液中Cr(VI)被還原成Cr(Ⅲ)的量少，而溶液中Cr(Ⅲ)除了與S2-發生雙水解反應，還可以與溶液中的OH-形成沉淀，所以去除率較大。

圖6 pH值對污染物的去除影響

2.2.3 反應時間對污染物去除率的影響

不同反應時間下SRB對Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖7所示。可看出，在反應進行0.5 d～2.5 d時，對Cr(VI)、SO42-的去除率由10.8%增加到95.2%，對Cr(Ⅲ)的去除率由7.9%增加到67.2%，對SO42-的去除率由16.7%增加到68.4%，可見，該階段的SRB處于對數生長期，隨著接觸時間的增長，反應進行的越完全。在反應進行3d時Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除率即可達到最大，分別為95.8%、68.7%、70.8%。

圖7 反應時間對污染物的去除影響

2.2.4 反應溫度對污染物去除率的影響

不同反應溫度下SRB對Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除效果如圖8所示。可看出，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率在溫度為35℃時達到最大值，分別為95.8%、68.7%、70.8%，說明SRB受溫度影響，35℃可使SRB保持最佳的活性，溫度過高或者過低會影響到SRB的活性，導致Cr(VI)和SO42-的還原量減少，Cr(VI)還原為Cr(Ⅲ)的量雖然減少，但是Cr(Ⅲ)的去除率也較低，是因為SO42-的還原量少使得生成的S2-量也少，從而S2-與Cr(Ⅲ)發生雙水解的量也少，所以最佳的反應溫度為35℃。

圖8 溫度對污染物的去除影響

2.3 二次回歸正交旋轉組合設計對污染物去除條件優化

建立SRB處理冶金酸性廢水中鉻實驗的三元二次正交旋轉設計回歸方程，得到Cr(VI)、Cr(Ⅲ)和SO42-的去除率結果見表2所示。

表2 二次回歸正交旋轉組合試驗設計及結果

*ya-SO42-去除率；yb-Cr(Ⅵ)去除率；yc-Cr(Ⅲ)去除率

經過二次方差分析剔除不顯著項后，結果顯示各項均達到顯著水平，最后確定SO42-、Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的回歸方程分別為：

(2)

(3)

(4)

在3個實驗因素的編碼范圍[-1.682,1.682]內，通過Excel規劃求解，得到：當x1=3.3，x2=3.4，x3=34，即SRB投加量為3.3%、反應時間為3.4 d、反應溫度為34 ℃時，SO42-、Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的去除率分別可達到理論值69.78%、100%、65.46%。

3 結論

(1)通過對細菌進行純化培養以及革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、TEM分析、基因測序等鑒定手段，得到該菌株無芽孢、有鞭毛、為檸檬酸性桿菌、生化類型為兼性厭氧型。

(2)SRB處理200 mL含Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的冶金酸性廢水結果發現：SRB菌懸液體積比為3%(細菌計數得到菌液的菌密度為3×108個/mL)、pH=7、反應溫度為35℃、反應進行3 d時，對Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分別為95.8%、68.7%、70.8%，說明該菌株為耐鉻、嗜中溫、中性菌。

(3)回歸正交旋轉實驗對SRB處理冶金酸性廢水的條件優化結果表明：當SRB投加體積比3.3%(細菌計數得到菌液對數期的菌密度為3×108個/mL)、反應時間為3.4 d、反應溫度為34 ℃時，Cr(VI)、Cr(Ⅲ)、SO42-的去除率分別可達到理論值100%、65.46%、69.78%。