RORα在脂多糖所致小鼠巨噬細胞炎癥反應中的表達變化與作用實驗研究*

孟衛榮，李珍珍，韓軍濤

空軍軍醫大學第一附屬醫院燒傷與皮膚外科(西安 710032)

巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞，是釋放炎癥介質的固有免疫主力軍，因此在調控炎癥反應中起到了核心作用[1-2]。在膿毒癥初期，該細胞被激活，釋放大量炎癥相關因子，從而引發炎癥級聯放大反應，最終導致全身性炎癥反應[2-5]，因此，巨噬細胞的異常活化在機體失控性炎癥反應，以及引發的多臟器功能衰竭甚至膿毒癥等病理過程中發揮著至關重要的作用。由此，控制巨噬細胞炎癥反應尤為重要。核受體(Nuclear receptors，NRs)是配體調控的轉錄因子，在機體中主要起調節代謝、發育和免疫等作用[6-7]。其中“視黃酸相關孤核受體”(Retinoid-related orphan receptors，RORs)屬于NR超家族，有研究表明，RORs亞家族RORα在免疫細胞尤其是巨噬細胞中高表達[6,8]。RORα敲除小鼠中，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘發的炎癥介質釋放水平明顯高于野生鼠，同時，敲除鼠中腹腔內巨噬細胞在LPS刺激下，其炎癥因子的表達量是野生小鼠巨噬細胞的5～10倍[9-10]。由此看來，RORα對機體免疫系統以及巨噬細胞炎癥反應具有潛在的調控作用。然而，RORα在LPS誘發巨噬細胞炎癥反應中的表達變化，以及對炎癥反應的調控作用尚不明確。本研究通過分離小鼠骨髓來源的巨噬細胞(Bone marrow derived macrophages，BMDMs)，觀察LPS在不同時間點刺激巨噬細胞發生炎癥反應條件下，RORα的轉錄和蛋白表達水平變化，以及RORα激動劑和抑制劑分別預處理后，對LPS誘發炎癥因子釋放的影響，初步驗證RORα對脂多糖所致小鼠巨噬細胞炎癥反應具有緩解作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 動物：實驗動物選取健康的6～8周雄性C57BL/C6小鼠，體重(25±5)g，飼養條件為晝夜節律12 h/12 h，自由飲水攝食。所有實驗動物均由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，實驗中動物操作及處理均符合空軍軍醫大學動物倫理委員會定制的原則及操作規范。

1.2 細胞培養與分組：小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)取自6～8周雄性C57BL/C6小鼠，小鼠頸椎脫臼處死后，取雙側股骨與脛骨，移至超凈工作臺，使用1 ml注射器沖洗骨髓并收集，1000 r/min離心5 min，使用含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸后，在37℃，5% CO2孵箱中培養過夜，去除貼壁較快的雜細胞，收集未貼壁細胞鋪于細胞培養皿中，加入20 ng/ml巨噬細胞集落刺激因子，培養5 d后，對細胞進行分組處理。熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測100 ng/ml LPS處理不同時間點：0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h的白細胞介素-1β(Interleukin1β,IL-1β)和RORα轉錄水平的變化。不同處理組血清中炎癥因子的含量：①正常組：1∶1000 DMSO；②LPS組：100 ng/ml LPS；③5 μmol/L SR1078+100 ng/ml LPS；④10 μmol/L SR3335+100 ng/ml LPS。SR1078/SR3335作用24 h后，加入LPS處理2 h后取樣觀察，每種條件重復5次，本試驗至少可以獲得3次可重復結果。

1.3 主要試劑：RPMI 1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；巨噬細胞集落刺激因子購自美國PeproTech公司；LPS購自美國Sigma公司；SR1078和SR3335購自美國MCE公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司；RORα和GAPDH一抗購自中國Proteintech公司；ELISA試劑盒購自中國欣博盛生物公司。

2 實驗方法

2.1 qRT-PCR法檢測細胞中蛋白轉錄水平：BMDMs分別加入100 ng/ml LPS處理不同時間點：0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h后，使用Trizol裂解法提取RNA，步驟嚴格按照Invitrogen公司的實驗步驟進行，每組進行5個重復。得到的RNA用分光光度計讀取OD260/OD280比值及RNA濃度。反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA后，利用TB Green試劑盒進行熒光定量PCR，分別以小鼠IL-1β，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和RORα為引物，IL-1β上游引物 5’-CAACCAACAAGTGATATTCT

CCATG-3’，下游引物5’-GATCCACACTCTCCAGC

TGCA-3’， TNF-α上游引物5’-TATGGCCCAGACCCTCACA-3’，下游引物5’-GGAGTAGACAAGGTACAACCCATC-3’， RORα上游引物5’-TCAGCAGAGCAATGCCACCTAC-3’，下游引物5’-TGGACATCCGACCAAACTTGAC-3’；以小鼠GAPDH作為內參，上游引物5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物5’-TTGCTGTTGAAGTC

GCAGGAG-3’，反應體系為20 μl，利用2ΔΔCT法計算分析。

2.2 免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中RORα蛋白水平：BMDMs分別加入100 ng/ml LPS處理不同時間點：0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h后，加入RIPA細胞裂解液收集細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度后，加入上樣緩沖液Loading buffer，100 ℃處理5 min。取20 μg蛋白樣品加樣到10% SDS-PAGE膠中，電泳約2 h后，100 V恒壓轉膜60 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，孵育相應一抗4 ℃過夜，RORα一抗(1∶1000)和GAPDH一抗(1∶2000)。二抗(1∶4000)室溫孵育2 h后，ECL 方法顯影成像，并用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

2.3 ELISA法檢測細胞培養液上清中炎癥因子IL-1β，TNF-α和白介素6(Interleukin-6，IL-6)的含量：各組細胞SR1078/SR3335作用24 h后，加入LPS處理2 h后取出細胞上清液，1000 r/min離心5 min后收集上清。步驟嚴格按照欣博盛生物公司的ELISA試劑盒說明進行，每個樣做5個復孔，按照步驟加入各種反應試劑，根據樣品在波長450 nm的酶標儀中讀取OD值，與同時制作的標準曲線進行對比，計算細胞上清液中炎癥因子的濃度。

結 果

1 BMDMs在LPS處理不同時間點蛋白轉錄水平的表達 BMDMs在LPS處理0 h、1 h、2 h、 6 h、12 h和24 h后，對其進行炎癥因子IL-1β和TNF-α轉錄水平的檢測，結果顯示，LPS處理后，IL-1β和TNF-α的轉錄水平均出現了顯著升高(P<0.01 vs 0 h)，且在2 h左右出現了峰值，與0 h相比，IL-1β值為(204.98±42.04)，TNF-α值為(23.77±3.37)，提示LPS處理致使BMDMs釋放炎癥因子，出現炎癥反應。同時檢測RORα轉錄水平變化，結果發現，與處理0 h相比，RORα表達水平在1-12 h均出現了明顯降低(P<0.01)，且在2 h左右最為顯著，說明在BMDMs炎癥反應過程中，RORα表達受到抑制，且與炎癥因子IL-1β和TNF-α表達成負相關，初步提示RORα可能參與了巨噬細胞炎癥反應過程，見表1。

表1 BMDMs在LPS處理不同時間點蛋白轉錄水平的表達

注：與0 h相比,*P<0.01

2 BMDMs在LPS處理不同時間點RORα蛋白水平的表達 為了進一步驗證RORα在BMDMs炎癥反應中的表達變化，我們通過Western blot法檢測其蛋白水平，結果顯示，與LPS處理0 h相比，RORα蛋白表達水平在處理1 h、2 h、6 h和24 h均出現了顯著的降低(P<0.05，P<0.01)，且與轉錄水平變化相似，進一步提示RORα在LPS刺激下表達水平受到顯著抑制(圖1)。

注：與0 h相比，*P<0.05，#P<0.01

3 RORα對LPS所致巨噬細胞炎癥因子釋放的影響 對BMDMs進行預處理，一組加入RORα激動劑5 μmol/L SR1078，一組加入RORα拮抗劑10 μmol/L SR3335，處理24 h后，加入LPS處理，2 h后，利用ELISA法檢測各組細胞培養液上清中炎癥因子IL-1β，TNF-α和IL-6的含量，結果顯示，LPS組中，IL-1β，TNF-α和IL-6的含量均出現顯著上調(P<0.01)，而在SR1078預處理組中，與LPS組相比，IL-1β，TNF-α和IL-6含量均出現顯著降低(P<0.05，P<0.01)，同時，SR3335與處理組中，得到了相反結果，即與LPS組相比，IL-1β，TNF-α和IL-6含量均明顯升高(P<0.05)。以上結果提示，RORα能夠顯著抑制LPS所致的巨噬細胞炎癥因子的釋放。見表2。

表2 BMDMs細胞炎癥因子含量的表達(pg/ml)

注：與正常組相比,*P<0.01；與LPS組相比,#P<0.05，△P<0.01

討 論

巨噬細胞作為重要的固有免疫細胞，是機體在血液和組織器官循環中抵御疾病的第一道防線，當機體受到外界病菌侵入時，巨噬細胞通過吞噬和降解作用清除抗原和細菌的同時，釋放IL-1β和TNF-α等炎性介質導致炎癥反應[1,11-12]，在炎癥反應過程中，巨噬細胞既是啟動細胞，也是效應細胞，炎癥因子的釋放可進一步激活巨噬細胞，導致炎癥的級聯瀑布效應，從而導致全身的炎癥反應綜合征，最終引發膿毒癥休克、多臟器損傷等癥狀[4,13-14]，因此，巨噬細胞的異常活化在炎癥反應中發揮著重要作用。臨床上由細菌感染引發的膿毒癥占到了95%以上，而細菌感染引起的內毒素LPS的釋放是導致膿毒癥的主要因素[5,15-16]，因此，本研究采用LPS刺激BMDMs，觀察對其炎癥因子表達的影響，結果發現，LPS在1～24 h不同時間點處理下，炎癥因子IL-1β和TNF-α的轉錄水平均出現了顯著的升高，提示LPS可誘發巨噬細胞發生炎癥反應。

RORα在各個組織中廣泛表達，且在免疫系統，尤其是巨噬細胞中高表達[9,17]。研究表明，RORα在巨噬細胞中的表達受到嚴格控制，在靜息狀態下，RORα高表達，而Toll樣受體被激活時，其表達水平顯著受到抑制[9-10]，提示RORα可能具有控制巨噬細胞炎癥反應的作用。本研究在LPS激活BMDMs發生炎癥反應時，發現RORα轉錄和蛋白水平均受到顯著下調，尤其在1～6 h，且2 h時最為顯著，與炎癥因子的表達水平呈負相關，這與前期研究結果相符，提示RORα可能參與了炎癥因子的釋放。在RORα基因敲除鼠中，LPS誘發的炎癥因子的釋放水平明顯高于野生鼠，同時，敲除鼠中腹腔內巨噬細胞在LPS刺激下，其炎癥因子的表達量是野生小鼠巨噬細胞的5～10倍[17- 18]。提示RORα對巨噬細胞炎癥反應具有潛在的調控作用。本研究通過采用RORα激動劑SR1078和拮抗劑SR3335預處理巨噬細胞，使其在細胞中高表達或抑制表達，進而觀察LPS刺激下，巨噬細胞的炎癥介質釋放情況，發現在SR1078預處理的細胞中，LPS刺激下，其炎癥因子的釋放受到了顯著的抑制作用，而拮抗劑SR3335的作用正好相反，進一步活化了巨噬細胞炎癥因子的釋放，該結果說明RORα能夠顯著抑制LPS誘發的巨噬細胞炎癥因子的釋放，進而緩解炎癥反應。

綜上所述，本研究通過LPS激活BMDMs釋放炎癥因子，誘發炎癥反應的同時，RORα轉錄水平和蛋白水平均受到顯著的抑制作用，而當誘導RORα表達上調或者下調后，LPS對巨噬細胞炎癥介質的釋放具有顯著的抑制或促進作用，提示RORα在巨噬細胞調控炎癥反應中發揮著重要的作用，這為減輕失控性炎癥反應提供新的理論基礎和治療靶點。