微小RNA-195-5p與腦源性神經營養因子在哮喘急性發作期患兒血清中表達相關性研究

林 惠,顏 芬

上海市嘉定區安亭醫院兒科(上海 201805)

支氣管哮喘是臨床中的常見疾病，尤其好發于兒童，也是對兒童影響較大的呼吸道疾病。病變形成中涉及多種細胞因子的改變[1]。微小RNA(miRNA)是一類長度約22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其在多種疾病中可以檢測到異常表達。MiRNA是近年關注的與哮喘形成有關的細胞因子[2]，對調控免疫性炎癥及炎性因子均有作用。MiRNA的作用主要是通過對靶基因的調控實現的[3]。應用生物信息學對哮喘患兒血清中表達異常的miRNA進行篩選，選擇可能表達異常，且罕見報道的微小RNA-195-5p(miR-195-5p)進行研究，并應用TargetScan軟件預測其靶基因，選擇近年關注較多的且關聯性強的腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)進行研究[4]。本實驗將探討miR-195-5p和BDNF在哮喘急性發作期患兒血清中的表達，分析其相關性及臨床意義。

資料與方法

1 一般資料 選擇2017年8月至2019年6月在我院確診為哮喘急性發作期的患兒69例作為觀察組。病例納入均符合《兒童支氣管哮喘診斷及防治指南》中的診斷標準，患兒伴有突然發生喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，或原有癥狀急劇加重；發作時雙肺可聞及散在性或彌漫性哮鳴音，伴呼氣延長。選擇確診為哮喘臨床緩解期的患兒69例作為對照組，患兒主要是經過治療或未經治療癥狀、體征消失，肺功能恢復到急性發作前水平，并維持3個月以上。排除標準：①心、肺等器質性疾病引起的喘息；②伴有先天性疾病或自身免疫性疾病；③患兒或家屬依從性差者。選擇經體檢證實為無明顯器質性疾病的兒童血清標本69例作為正常對照組。本研究經醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》中的要求，家屬簽屬知情同意書。觀察組共69例，男38例，女31例，年齡2～14歲，平均(7.4±2.8)歲，首發15例，復發54例(復發次數為2～12次)。對照組共69例，男36例，女33例，年齡3～14歲，平均(7.8±2.1)歲，首發11例，復發58例(復發次數為2～10次)。正常對照組共69例，男35例，女34例，年齡5～14(6.5±2.7)歲。三組在一般資料的比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 miR-195-5p的檢測：抽取三組的空腹靜脈血3 ml，離心(3000 r/min)20 min，留取血清。-80℃凍存。樣本均于1個月內集中檢測。應用實時熒光定量PCR法(qPCR)檢測miR-195-5p的表達。首先提取總miRNA，逆轉錄合成cDNA。引物上游：5’-TCGAGTCATGTTCACCGGACTG-3’，下游：5’-TCCCACGTGACGACGTCTAT-3’。以U6為內參，引物上游：5’-CACGAGAGAACGCGCATTA-3’下游：5’-GCAGTCATTCAACTCGAATC-3’。引物由蘇州睿贏生物技術公司合成。反應程序：50 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共32個循環；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s延伸。在60 ℃時采集熒光信號，記錄Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-195-5p的相對表達量。

2.2 BDNF的檢測：ELISA法檢測三組血清中BDNF的含量。試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。嚴格按實驗操作完成檢測，用450 nm的酶標儀測量各個孔內的吸光度值，依據OD值，繪制標準曲線，查取對應的BDNF值。

結 果

1 三組中miR-195-5p和BDNF表達的比較 三組中miR-195-5p和BDNF的表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1(圖1、2)。

2 觀察組不同臨床特征中miR-195-5p和BDNF表達的比較 MiR-195-5p和BDNF在觀察組不同病變嚴重程度、是否首次發病的分組中差別有統計學意義(P<0.05)，而在不同性別、年齡的分組中差別無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 三組中miR-195-5p和BDNF表達的比較

表2 觀察組不同臨床特征中miR-195-5p和BDNF表達的比較

注：與其他組比較，***P<0.05

3 觀察組中miR-195-5p與BDNF的相關性 應用Pearson相關分析顯示，觀察組miR-195-5p和BDNF呈負相關性(r=-0.61,P=0.013,圖3)。

圖3 觀察組miR-195-5p與BDNF的相關性

討 論

哮喘發病機制與多種因素有關，近年研究認為其發生有免疫機制、遺傳機制及神經受體調控機制等[5]。神經受體調控機制認為支氣管哮喘是一種由神經調節引起的病變，認為神經肽及神經營養因子等均參與病變的形成。此通路主要表現為腎上腺素能受體失衡，同時神經營養因子的形成和分泌量發生改變，引起神經源性炎癥的形成。研究認為當抗原首次進入機體后，T細胞被活化，并激活Th2細胞，經白介素調節后進一步激活B細胞并合成IgE，此過程需要miRNA和BDNF的參與[6-8]，這可能是神經調控機制主要方式。也有研究認為哮喘病變形成時神經元突觸傳遞與可塑性出現明顯變化，細胞因子的表達量增加，如BDNF等，由于BDNF受控于多種因子，因此其調控機制涉及多種信號通路的作用，其中就包括miRNA的調節[9-10]。MiRNA是復雜分子調控網絡的一部分，其常作為上游因子調控下游靶基因的表達。MiRNA是非編碼RNA，其發揮作用的方式主要與靶 mRNA 的 3’UTR 進行結合，使mRNA 的翻譯功能發生改變，調節mRNA 下游的靶因子來調控細胞的病理過程[11]。本實驗篩選出的miR-195-5p具有調節神經營養因子的作用。MiR-195-5p可能與神經營養因子的調控有關[12]。BDNF是近年關注的與神經調控相關的因子，其在神經細胞中具有保護作用，而在炎性及免疫性疾病時分泌增加，具有對組織和細胞的損傷作用。還有學者認為BDNF可能對激活炎癥反應有促進作用[9]。因此機體中BDNF的表達特征與不同疾病有關。BDNF對免疫性炎癥的形成有重要作用，可以減少神經細胞的可塑性[13]。

本研究結果顯示miR-195-5p在哮喘急性發作期患兒血清中低表達、BDNF在血清中高表達，且miR-195-5p和BDNF在不同病變嚴重程度、是否首次發病的分組中差異有統計學意義，提示miR-195-5p和BDNF異常表達對病變的形成和進展可能有一定作用。MiR-195-5p低表達、BDNF高表達對預測病變的發生有重要價值，尤其是首次發作時，二者可能是客觀指標。MiR-195-5p可能是病變中重要的調控因子。MiR-195-5p在機體中的作用途徑可能更多，如減少巨噬細胞和白細胞的吞噬作用，使損傷因子的清除能力下降。巨噬細胞誘發的急、慢性炎癥在哮喘中有重要作用，其效應因子是IL-18。哮喘發展過程中可以使局部釋放較多的細胞因子，并通過NO依賴途徑加速表面上皮和間質細胞的死亡[14]。MiR-195-5p對巨噬細胞的作用通過生物信息學分析也得到間接證實，其靶因子包括CD68和溶菌酶等。本研究顯示miR-195-5p與BDNF具有負相關性，提示miR-195-5p與BDNF之間具有負向協同作用，間接證實了生物信息分析的結果，也提示miR-195-5p對BDNF有調控作用[15]。但BDNF是否能作為miR-195-5p的靶點尚需要雙熒光素酶等基礎實驗進行驗證。活化后的BDNF對呼吸道上皮的修復和區段的重塑有一定價值，對轉錄也可能具有一定的調控作用。也有研究認為miR-195-5p表達下降，可以引起細胞內炎性小體的活性增強，伴隨著氧自由基的產生，引起局部組織的損傷。

總之，哮喘急性發作期患兒血清中miR-195-5p低表達、BDNF高表達，參與病變的形成，二者具有負向協同作用。