生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)方法的優(yōu)化

楊小平，酈娟，何榮，曾慧君，楊永

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢430012）

0 引 言

β-內(nèi)酰胺酶為細(xì)菌代謝產(chǎn)生的一種蛋白，能裂解青霉素和頭孢類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使抗生素失活[1-2]。β-內(nèi)酰胺酶的分類有兩種方法：布氏法和Ambler的分子分類法[3-5]。近些年，部分不法生產(chǎn)者將其作為生鮮牛乳抗生素分解劑使用[6]，使牛乳達(dá)到乳品檢驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)[7]。生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶來(lái)源于兩個(gè)方面：外源性非法添加；內(nèi)源性誘導(dǎo)因素，牛體內(nèi)或牛乳中產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的微生物造成牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的殘留[8]。

目前關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法有頭孢硝基噻吩顯色法、酸度法、碘量法、高效液相色譜法、依賴基質(zhì)輔助激光解吸/電離傅立葉變換質(zhì)譜(MALDI-FTMS)法、酶聯(lián)免疫法和微生物杯碟法[9-11]。食品整治辦〔2009〕29 號(hào)文（后稱29 號(hào)文）中規(guī)定了乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法為杯蝶法。杯碟法的靈敏度高、結(jié)果判定簡(jiǎn)單，基本可以滿足乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的需求，但在實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多方面的問(wèn)題，如不同廠家的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，所用酶活性單位不一致，試驗(yàn)中青霉素G、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶最適使用濃度的選擇與搭配[12]；生鮮乳中內(nèi)源性殘留β-內(nèi)酰胺酶與產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株之間的關(guān)系等[13]，這些問(wèn)題已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道。在日常杯蝶法檢驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)了其他的問(wèn)題，如：抑菌圈形狀不規(guī)則，邊緣模糊，導(dǎo)致抑菌圈直徑偏差大，影響結(jié)果判斷；29 號(hào)文中規(guī)定的菌液濃度不易控制；牛津杯內(nèi)樣液易泄露造成試驗(yàn)失敗；陰性對(duì)照試驗(yàn)不成立，試驗(yàn)失敗率高等問(wèn)題。對(duì)此，我們?cè)谌粘z驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)積累中對(duì)29 號(hào)文的方法進(jìn)行了部分改進(jìn)與優(yōu)化，為我國(guó)制定更加合理、科學(xué)的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藤黃微球菌經(jīng)復(fù)蘇后活化三代左右，直接劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，可按工作需求接種多支斜面，作為工作菌株存放于4 ℃冰箱，一般可存放一個(gè)月；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，平板計(jì)數(shù)瓊脂，抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer；青霉素 G 鈉鹽，德國(guó) Dr.Ehrenstorfer；β-內(nèi)酰胺酶，購(gòu)自東京化學(xué)工業(yè)公司（TCI）。

恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；游標(biāo)卡尺，上海田島工具有限公司；滅菌鍋，松下電器（中國(guó)）有限公司；高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；牛津杯，新鄉(xiāng)市新華檢測(cè)儀器廠；0.45 μm 無(wú)菌過(guò)濾器，密理博。

1.2 試驗(yàn)方法與優(yōu)化

1.2.1 菌懸液的制備

試驗(yàn)前一天取4 ℃保存的藤黃微球菌斜面一支，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)16～24 h 后，將平板上的藤黃微球菌刮入5 mL 無(wú)菌EP 管內(nèi)，用2 mL無(wú)菌生理鹽水懸浮菌株制成菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，制成工作菌懸液。

1.2.2 樣品制備

檢驗(yàn)前先將生鮮乳樣品搖勻，取樣品20 mL 至離心管中，12 000 rpm/min 離心5 min，用注射器吸取離心后的生鮮乳，注意盡量不要吸到表層的脂肪質(zhì)以防堵塞無(wú)菌過(guò)濾器，連接無(wú)菌過(guò)濾器，將生鮮乳過(guò)濾到另一個(gè)無(wú)菌EP管內(nèi)待用。用無(wú)菌水做陰性對(duì)照。

1.2.3 檢驗(yàn)用平板的制備

取一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿，先在底層鋪一薄層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，晃動(dòng)鋪勻，凝固備用；取上述制備好的菌懸液，加入不燙手的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，將含菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基倒入上述平板中，晃動(dòng)鋪勻，凝固備用；取滅菌的牛津杯，在酒精燈上稍加熱后，將牛津杯放置在上述營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，使牛津杯與瓊脂表面形成輕度粘連，每塊平板放置四個(gè)牛津杯，待用。

1.2.4 樣品測(cè)定

采用杯蝶法測(cè)定生鮮乳中殘留的β-內(nèi)酰胺酶，測(cè)定體系中關(guān)于青霉素、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶的濃度確定可按照參考文獻(xiàn)[12]的方法原理，通過(guò)抑菌圈的大小先確定青霉素的濃度與用量，再確定β-內(nèi)酰胺酶的濃度與用量，最后確定舒巴坦的濃度和用量。

1.2.5 結(jié)果報(bào)告

陰性對(duì)照：A，B，D 均產(chǎn)生抑菌圈且|A－B|≤3 mm 且|D－C|≥3 mm，重復(fù)性良好。陰性對(duì)照成立是試驗(yàn)成功的前提。

陽(yáng)性：B，D 均產(chǎn)生抑菌圈且|C－D|≥3 mm 且|B－A|≥3 mm，重復(fù)性良好。

陰性：B，D 均產(chǎn)生抑菌圈且|C－D|≥3 mm 且|B－A|≤3 mm，重復(fù)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液的濃度控制

在試驗(yàn)中，我們選擇了系列濃度梯度的藤黃微球菌菌懸液，加入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行測(cè)試，以陰性對(duì)照為例，各個(gè)不同菌量的試驗(yàn)條件下，抑菌圈直徑如表1 所示。從抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)分析，加入菌懸液的量對(duì)抑菌圈的直徑大小基本無(wú)影響，所以在實(shí)際檢驗(yàn)中不需要刻意控制，只需要保證藤黃微球菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)雜菌污染即可。

2.2 樣品前處理對(duì)抑菌圈的影響

在檢驗(yàn)中，我們比較了離心去脂肪層與無(wú)菌過(guò)濾處理和未做前處理的生鮮乳樣品，使用同樣的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，離心與無(wú)菌過(guò)濾處理的生鮮乳樣品組，其抑菌圈呈圓形，邊緣清晰可見(jiàn)，比較規(guī)則，抑菌圈直徑易測(cè)量，測(cè)量數(shù)據(jù)基本無(wú)波動(dòng)（圖1）；而未經(jīng)過(guò)離心過(guò)濾處理的生鮮乳樣品，其抑菌圈不規(guī)則，有時(shí)類似橢圓形，有時(shí)呈蔓延式生長(zhǎng)，有時(shí)抑菌圈邊緣不清晰，抑菌圈直徑不易測(cè)量。生鮮乳樣品如果不離心分離乳脂肪顆粒，基本無(wú)法過(guò)濾。以某養(yǎng)殖場(chǎng)某批次生鮮乳為樣品，將經(jīng)過(guò)離心與無(wú)菌過(guò)濾處理以及未處理的樣品分別進(jìn)行檢驗(yàn)，做三個(gè)平行，取A、B、C、D 管抑菌圈直徑的平均值，結(jié)果如表2所示。

表1 不同濃度的菌懸液測(cè)量的抑菌圈直徑

圖1 離心和無(wú)菌過(guò)濾的樣品檢驗(yàn)平板

表2 離心過(guò)濾處理與未處理的樣品測(cè)定結(jié)果

2.3 檢驗(yàn)用平板的制備技巧

按照29 號(hào)文的要求，檢驗(yàn)中需要用到抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ，在實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，完全可以用營(yíng)養(yǎng)瓊脂代替抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ，制備檢驗(yàn)平板時(shí)，平板底層和含菌層只使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂，足以滿足藤黃微球菌生長(zhǎng)繁殖中對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，以陰性對(duì)照為例，使用抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ和營(yíng)養(yǎng)瓊脂的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。在制備檢驗(yàn)用平板時(shí)，需要將牛津杯放置在混合有藤黃微球菌的瓊脂面上，若直接放置牛津杯，在加樣品溶液、加蓋培養(yǎng)皿蓋、轉(zhuǎn)運(yùn)檢驗(yàn)平板時(shí)，極可能會(huì)導(dǎo)致牛津杯內(nèi)的樣品溶液直接泄露到檢驗(yàn)平板上，這將導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)的失敗。所以在制備檢驗(yàn)用平板時(shí)，第二層混合有藤黃微球菌的瓊脂層不必太厚，能夠覆蓋即可；同時(shí)在放置牛津杯時(shí)，可將牛津杯在酒精燈上稍加熱，讓牛津杯的余熱融化少量瓊脂，冷卻后，牛津杯將和瓊脂表面輕微粘連在一起，能有效防止牛津杯內(nèi)樣品溶液的泄露。

表3 使用抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ和營(yíng)養(yǎng)瓊脂的抑菌圈直徑

2.4 青霉素、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶最佳使用濃度的確定

根據(jù)試驗(yàn)原理，青霉素抑制藤黃微球菌的生長(zhǎng)，β-內(nèi)酰胺酶能降解青霉素，舒巴坦能抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性。所以我們先確定青霉素的濃度與用量，再確定β-內(nèi)酰胺酶的濃度和用量，最后確定舒巴坦的濃度與用量。整個(gè)試驗(yàn)體系的關(guān)鍵是青霉素、舒巴坦、β-內(nèi)酰胺酶三者之間的濃度與使用量的配比。關(guān)于青霉素的濃度與用量，參照29 號(hào)文使用量5 μL，我們配制了不同濃度的青霉素工作液，抑菌圈直徑如表4所示。可以發(fā)現(xiàn)，按照29號(hào)文的濃度與用量，0.1 mg/mL的青霉素溶液，產(chǎn)生的抑菌圈直徑能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

表4 不同青霉素濃度的抑菌圈直徑

β-內(nèi)酰胺酶的濃度與用量是本試驗(yàn)的關(guān)鍵。在確定好青霉素的濃度與使用量之后，根據(jù)29 號(hào)文中的判定規(guī)則，純水陰性對(duì)照的結(jié)果為A、B、D 均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈，C 不產(chǎn)生抑菌圈，據(jù)此來(lái)確定β-內(nèi)酰胺酶的濃度與用量。29 號(hào)文中規(guī)定β-內(nèi)酰胺酶的濃度為16 000 U/mL，使用量為25 μL。目前市面上常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶主要有TCI 和Sigma 公司生產(chǎn)，其酶活性單位并不統(tǒng)一。嚴(yán)格來(lái)講，需要依照中華人民共和國(guó)藥典（2015 版）第四部生物活性測(cè)定法中青霉素酶及其活力測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定酶活，但實(shí)際檢驗(yàn)中如此操作會(huì)比較麻煩。我們可以參照β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)簽說(shuō)明配制β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)工作液，β-內(nèi)酰胺酶的濃度與使用量以C 剛好不產(chǎn)生抑菌圈為宜，即C 管內(nèi)的β-內(nèi)酰胺酶剛好可以全部失活A(yù) 管內(nèi)的青霉素。因每個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用的β-內(nèi)酰胺酶品牌不統(tǒng)一，β-內(nèi)酰胺酶的活性單位也不統(tǒng)一，所以本文不提供β-內(nèi)酰胺酶的具體濃度與使用量。

舒巴坦的濃度和用量則依據(jù)D 的抑菌圈直徑來(lái)確定。實(shí)際檢驗(yàn)中如果完全依照29 號(hào)文中的試劑濃度與用量進(jìn)行檢驗(yàn)，以陰性對(duì)照為例，發(fā)現(xiàn)D 沒(méi)有產(chǎn)生抑菌圈，或者D 產(chǎn)生的抑菌圈與C 相比小于3 mm，這說(shuō)明β-內(nèi)酰胺酶過(guò)量，需要降低β-內(nèi)酰胺酶的用量，或者增加舒巴坦的用量，確保在陰性對(duì)照中D 產(chǎn)生的抑菌圈與C 相比大于3 mm。根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，D 的抑菌圈直徑在16 mm 左右為宜。

3 討論與總結(jié)

在試驗(yàn)中我們首先探討了藤黃微球菌的菌懸液濃度與抑菌圈直徑之間的關(guān)系。通過(guò)大量的試驗(yàn)證實(shí)，在日常檢驗(yàn)中無(wú)需刻意調(diào)整菌懸液的濃度，菌懸液的濃度與用量不影響抑菌圈的直徑大小，只是最終檢驗(yàn)平板的顏色有深淺的區(qū)別。因?yàn)樘冱S微球菌對(duì)青霉素高度敏感，所以試驗(yàn)菌株的菌量對(duì)抑菌圈的直徑無(wú)影響。生鮮乳中各類微生物較多，含量各異[14]，在檢驗(yàn)中如果對(duì)生鮮乳樣品不過(guò)濾除菌，理論上這些微生物將或多或少與青霉素發(fā)生相互作用，導(dǎo)致與藤黃微球菌發(fā)生作用的青霉素的量有變化，最終將影響抑菌圈的直徑，所以理論上樣品必須是無(wú)菌的。生鮮乳樣品離心去除脂肪顆粒，這些脂肪顆粒將直接影響過(guò)濾的效果與速率，如果不去除這些脂肪顆粒，這些脂肪顆粒還可能會(huì)與樣品溶液中的青霉素、舒巴坦或β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生相互作用，最終影響抑菌圈的直徑；同時(shí)，脂肪顆粒等大顆粒雜質(zhì)可能會(huì)限制青霉素、舒巴坦和β-內(nèi)酰胺酶在瓊脂層的擴(kuò)散，最終影響抑菌圈的形狀或直徑，所以生鮮乳樣品必須離心過(guò)濾除菌。在檢驗(yàn)用平板制備環(huán)節(jié)，我們優(yōu)化了培養(yǎng)基的使用，因?yàn)樘冱S微球菌的營(yíng)養(yǎng)要求不高，營(yíng)養(yǎng)瓊脂足以滿足其生長(zhǎng)中的營(yíng)養(yǎng)需求。通過(guò)微加熱巧妙的種植牛津杯，能有效防止牛津杯中的樣品溶液直接泄露到瓊脂平板上，提高試驗(yàn)的成功率。最后，通過(guò)陰性對(duì)照組中抑菌圈的直徑來(lái)調(diào)整試驗(yàn)體系中青霉素、舒巴坦和β-內(nèi)酰胺酶這三種試劑之間的濃度與使用量，確保整個(gè)試驗(yàn)體系的有效性。通過(guò)以上各種措施的聯(lián)合使用，將大大提高試驗(yàn)的成功率，試驗(yàn)結(jié)果的判定分析也更清晰，為制定食品中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。