離子交換色譜法測定調制乳粉和固體飲料中低聚木糖

宋戈，劉長玲，張勝楠

（黑龍江省華測檢測技術有限公司，哈爾濱150028）

0 引 言

低聚木糖是一類由2-9 個D-木糖分子分子以β-1, 4 木糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖[1]。低聚木糖作為一種可溶性膳食纖維[2],具有很好的生理特性,可以調節腸道菌群,預防癌癥,降低血壓、血脂和血糖等生理學功效,是一種提高免疫力、促進身體健康的理想益生元[3]。除被應用于調理腸胃、緩解便秘的保健食品中外，低聚木糖作為一種效價比較高的雙歧因子，現已成功地應用到調制乳粉、固體飲料等行業中，能高效準確地測定其中低聚木糖含量十分必要。目前常見的測定方法有通過直接測定木二糖至木七糖組分含量[1,4-6]的方法，但木四糖、木五糖木六糖標準品價格昂貴，木七糖和木八糖等高聚合度低聚木糖標準樣品難以獲取, 而且測定復雜基質的樣品時，木二糖和木三糖會受到雜質干擾無法準確定量。也有經酸水解為木糖來間接測定[7-13]的方法和再進行衍生反應后測定的方法[14]，但只適用于含量較高基質簡單的保健食品，前處理不適用基質復雜的調制奶粉和固體飲料中低聚木糖的提取與測定。

本研究嘗試復雜基質的調制乳粉和固體飲料樣品中低聚木糖提取和水解的條件，采用優化的離子色譜分析條件直接測定樣品水解前后木糖的含量，二者之差經換算后獲得低聚木糖的含量，操作簡便，結果可靠，干擾小，可為復雜基質的調制乳粉和固體飲料中低聚木糖含量的測定提供參考。

1 實 驗

1.1 儀器與設備

ICS-5000 離子色譜儀配備脈沖安培檢測器,thermo 公司；TTL-DCⅡ水浴加熱儀,北京同泰聯科技發展有限公司；pB-10 酸度計，德國Sartorius 公司；KQ-250DE 超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX3 渦旋混合器，德國 IKA 公司；SQP 天平，德國Sartorius公司。

1.2 材料與試劑

木糖(≥99%),德國 Dr.Ehretorfer 公司；50%氫氧化鈉(色譜純)、乙酸鈉(色譜純),SIGMA 公司；濃硫酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）,西隴公司；WatersOasis HLB 固相萃取柱 3cc/60mg,美國 Waters 公司；所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm 的超純水；以上試劑除標注的外均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液與淋洗液的配制

木糖標準儲備液(500 mg/L):準確稱取0.05 g(精確至0.1 mg)的木糖標準物質于50 mL 燒杯中,加入約10 mL 熱水,溶解后冷卻至室溫,用水稀釋至25 mL 容量瓶中,搖勻。

木糖標準工作溶液:取適量木糖標準儲備液,用水配制成質量濃度為 1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、1 000.0 mg/L的標準曲線工作溶液，現配現用。

淋洗液A 純水：電阻率≥18.2 MΩ·cm 的超純水。

淋洗液B 氫氧化鈉溶液(200 mmol/L)：取10.4 mL 50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1 000 mL，通入氮氣保護，緩慢搖勻。

淋洗液C乙酸鈉(500 mmol/L)混合溶液：稱取41 g無水乙酸鈉(精確至0.01 g)，用約500 mL 水溶解，0.22 μm 濾膜過濾，脫氣10 min，加入7.8 mL50%氫氧化鈉溶液，并用水稀釋至1 000 mL，通入氮氣保護，緩慢搖勻。

1.3.2 樣品處理

稱取調制乳粉或固體飲料約2.5 g 于50 mL 三角瓶中，加入20 mL (50±5 ℃）的水將試樣振蕩溶解并超聲20 min，再用1.0 mol/L NaOH 溶液調節溶液pH 值到4.5，用水定容至50 mL 過濾，此為水解前供試品溶液，濾液依次通過0.22 μm 水相濾膜和活化過的HLB凈化柱，棄去前面2 mL，收集后面溶液上機測定水解前木糖含量。準確移取5.0 mL 樣品濾液于帶螺紋蓋的水解玻璃管中，加1.0 mL 4.0 mol/L 硫酸溶液混勻后于沸水浴水解100 min，取出，冷卻，用水轉移到三角瓶中，再用1.0 mol/L NaOH 溶液調節溶液pH 值到4.5，用水定容至50 mL 過濾，濾液依次通過0.22 μm水相濾膜和活化過的HLB 凈化柱，棄去前面2 mL，收集后面溶液上機測定水解后木糖含量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：CarboPac PA10，250×4.6 mm；保護柱：CarboPac PA10，50×4 mm ；檢測器參數：Au 電極，Ag-Cl參比模式，標準四電位波形；流速：1.0mL/min。

淋洗條件：0～20 min，20 mmol/LNaOH；20.1～30 min，100mmol/L NaOH 500 mmol/L NaAc ；30.1～40 min，200 mmol/L NaOH ；40.1～50 min，20 mmol/L NaOH 。進樣方式:自動進樣；進樣體積:25 μL；柱溫:30 ℃。木糖標準溶液的色譜見圖1。

1.3.4 木糖與低聚木糖的換算

圖1 木糖標準溶液色譜

在水解過程中，低聚木糖的β-1, 4-糖苷鍵會斷裂并與水分子結合生成糖苷羥基，使得生成的木糖質量比水解前的低聚木糖質量高。水解后木糖與水解前的低聚木糖質量之比用平均轉化系數表示，其數值因低聚木糖的聚合度而異，均值約為1.06（以木二糖計）[1]。因此，測定樣品中水解前后木糖含量的差值除以1.06即為樣品中低聚木糖的含量。

2 結果與討論

2.1 水解條件的優化

低聚木糖由2～9 個木糖單元，以β-1, 4-糖苷鍵連接而成的低聚糖混合物[1]，易溶于水。文獻報道[7-14]均選取4 mol/L 硫酸在100 ℃的溫度條件下水解條件,以盡可能地完全水解低聚木糖。調制乳粉和固體飲料不同于文獻報道中的低聚木糖保健品和原料，成分較為復雜，為提高檢測的準確性，對含70.0 mg/L 低聚木糖的調制乳粉樣品溶液進行不同水解條件的測定。考察了在100 ℃的溫度條件下, 加入1 mL 4 mol/L 硫酸溶液，反應時間對測定結果的影響見圖2。

另外考察了在100 ℃的溫度條件下, 反應時間為100 min，加入4 mol/L 硫酸溶液，加入的硫酸溶液體積對測定結果的影響見圖3。最終確定為1.3.2 中的水解條件。

圖2 樣品水解時間對測定結果的影響

圖3 樣品水解酸度對測定結果的影響

2.2 色譜條件的確定

NaOH 溶液中所含有的OH-離子可以促進糖中羥基的酸性解離, 從而增強它們在陰離子交換色譜柱上的保留。各種糖在堿性條件下存在電離度的差異，可以通過調節洗脫液的組成及濃度實現分離。NaOH 作為常規洗脫液之一，在糖的分析中扮演著雙重角色，既為糖的電離提供堿性環境，同時也是洗脫劑，因此改變NaOH 的濃度對于糖的保留時間有較大的影響。調制乳粉和固體飲料水解后會有大量的半乳糖、葡萄糖和其他單糖生成產生，當淋洗液中NaOH 溶液的濃度過大，測定低聚木糖水解生成的木糖就會受干擾。采用20 mmol/L NaOH 為淋洗液等度洗脫時, 樣品中低聚木糖水解生成的木糖與樣品中乳糖水解產生的半乳糖、葡萄糖和其他單糖能完全分離，但是對于強保留的雜質洗脫不下來。沒能洗脫下來的雜質會對下一個樣品的測定產生影響，導致保留時間的不穩定和測定結果的重復性差，必須采用具有更強淋洗能力的醋酸鈉溶液進行洗脫[15-16]。NaAc 相對于NaOH 具有更強的洗脫力，采用1.3.3 的色譜條件，樣品中低聚木糖測定結果的穩定性和準確性較好。樣品水解前與水解后測定色譜見圖4和圖5。

圖4 調制乳粉水解前(a)與水解后(b)測定色譜

2.3 標準曲線和檢出限

取不同濃度1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L、1 000.0 mg/L 的木糖標準工作溶液，注入離子色譜儀，記錄目標峰峰面積。以峰面積與標準溶液濃度繪制線性回歸曲線，其線性關系為:y=13.717x-1.311，相關系數R2=0.9993,線性范圍1.0～1 000 mg/L，并以3 倍信噪比計算出固體樣品稱取2.5克的檢出限為200 mg/kg。

圖5 固體飲料水解前(a)與水解后(b)測定色譜

2.4 回收率和精密度

以同一個不含低聚木糖的配方乳粉為實驗材料，稱取2.5 g樣品后，再分別加入1.0 mg和5.0 mg的低聚木糖添加劑原料（純度大于95%），每個濃度的添加樣品進行8 次平行測定，計算回收率與回收率的相對標準偏差(RSD)。回收率在87.2%～102.9%，回收率的RSD 在3.89%～8.36%。同時對含低聚木糖的配方乳粉和固體飲料2 個樣品進行測試，每個樣品進行8 次平行測定，樣品測定值的RSD 在2.39%～6.56%。由此可以看出，測定結果的較為穩定，方法的重復性較好，準確性較好。

2.5 實際樣品的測定

按照本方法對市售的配方乳粉和固體飲料樣品進行低聚木糖含量的測定，結果見表1。從實際樣品的檢測結果來看，該方法的靈敏度和準確度可以滿足實際測試的需求。

表1 樣品中低聚木糖的含量

3 結 論

本文重點探討了復雜基質的調制乳粉和固體飲料樣品中低聚木糖水解的條件，將低聚木糖各組分完全水解為木糖，再結合優化的離子色譜分析條件直接測定樣品水解前后木糖的含量，二者之差經換算后獲得低聚木糖的含量。該方法具有良好的線性，操作簡便，結果可靠，干擾小，同時重復性好，準確度高，適合復雜基質的調制乳粉和固體飲料中低聚木糖含量的生產監測和日常監管檢測。