復方五味子口服液的制備及抗疲勞功能評價

孫靖輝，李 薇，李正祎，王春梅，李 賀，陳建光*

(1.北華大學藥理教研室，吉林 吉林 132013;2.北華大學2016級藥學研究生班，吉林 吉林 132013；3.吉林醫藥學院臨床檢驗基礎教研室，吉林 吉林 132013)

隨著當今社會生活方式的改變，人們壓力逐漸增加，疲勞成為我們值得注意的一個問題。如果人體長期處于疲勞狀態，會產生反應遲鈍、注意力減退和記憶力下降等癥狀，嚴重影響生活的質量，甚至產生病理性危害。因此，迫切需要開發安全、有效、可長期服用的功能食品來延緩疲勞[1]。

中藥是我國歷代醫家和勞動人民在長期的積累和探索過程中逐步發現而沿用至今的，是以我國特有的中醫理論為指導的藥物分支，其安全、低毒、療效肯定等特性使很多中藥品種成為“藥食同源”的范疇。本課題組依據中醫組方理論，選取五味子、黃芪和覆盆子為原料，經現代提取制備技術配制成復方五味子口服液，該配方藥物組成及提取工藝已獲得國家發明專利[2]。本研究通過單因素正交實驗優化提取工藝，制成復方五味子口服液，并通過動物實驗對其抗疲勞作用進行功效學驗證，為其臨床應用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

2.1 實驗材料

五味子由吉林省集安市五味子種植基地提供，黃芪和覆盆子購自于安圖市安興中藥飲片有限公司，以上藥材均由北華大學藥學院生藥教研室王維副教授鑒定為真品；葡萄糖(廣州化學試劑廠)；輔料蔗糖、苯酚、山梨酸鉀、濃硫酸(天津市福晨化學試劑廠)；肝糖原測試盒、乳酸測試盒、血清尿素氮測試盒(南京建成生物工程研究所)。旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；藥品粉碎機(江陰寶利JB-450)；Infinite M200酶標儀(瑞士Tecan公司)。

SPF級雄性ICR小鼠200只，平均分為4批分別進行以下實驗，體重(20±2)g，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(吉)2016-0003。

2.2 復方五味子口服液的制備

取五味子、黃芪、覆盆子(1∶5∶3)，置提取罐中，加入40倍量蒸餾水(90 ℃)，浸泡30 min，水煎煮3 h，200目過濾，重復3次，合并3次濾液。提取液減壓濃縮，放置室溫后，加95%乙醇至含醇量70%，攪勻后常溫靜置24 h，過濾，得醇溶液。減壓回收乙醇，加適量純化水至總量的70%，4 ℃靜置24 h，過濾，得濾液。糖漿配制：取蔗糖加適量純化水，煮沸，攪拌溶解，趁熱過濾，添加適量熱水，攪勻，得約80%糖漿，過微濾膜，孔徑0.5 μm，壓力0.3 MPa。得到復方五味子口服液。

2.3 復方五味子口服液的提取工藝優化

2.3.1單因素及正交試驗

本研究通過4個關鍵單因素對多糖提取工藝進行優化，即料液比A(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、提取時間B(1、2、3、4、5 h)、提取溫度C(60、70、80、90、100 ℃)和提取次數D(1、2、3、4、5次)，以這4個為單因素條件分別做試驗。

以單因素實驗為基礎，選擇料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(A、B、C、D)4個因素進行L9(34)正交試驗設計，詳見表1。

2.3.2苯酚硫酸法進行多糖含量測定

精密稱取無水D-葡萄糖對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，得對照品溶液(0.1 g/L)。吸取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL分別加入25 mL比色管中，補水至2 mL，搖勻。依次加入5 mL濃硫酸，1 mL 6%苯酚，振蕩后，室溫放置15 min，在最大吸收波長490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線方程，計算多糖得率。

表 1 正交試驗因素水平表

2.4 復方五味子口服液的抗疲勞作用

2.4.1負重游泳實驗

取小鼠48只(第1批)，分為4組，分別為對照組，復方五味子口服液低、中、高(SAR-L、M、H)劑量組(給藥量為0.015、0.03、0.06 mL/kg，灌胃前將各組給藥液體量統一稀釋為0.02 mL/g)。SAR各劑量組給予相應SAR溶液15 d，對照組給予同體積蒸餾水，在最后一次給藥后30 min，將小鼠單獨放入泳箱內中(水深>30 cm，溫度25 ℃±1 ℃)。在每只小鼠的尾根上裝載鉛皮(體重的5%)，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間(力竭標準為小鼠沉入水面以下10 s不能浮出)。

2.4.2血清尿素氮測定

取小鼠48只(第2批)，分組及給藥劑量如2.4.1，在最后一次給藥后30 min，不負重游泳(水溫30 ℃)90 min，休息60 min后采血，分離血清，運用試劑盒測量血清尿素氮的含量。

2.4.3肝糖原測定

取小鼠48只(第3批)，分組及給藥劑量如2.4.1，在最后一次給藥后30 min，不負重游泳(水溫30 ℃)90 min后立即處死，取肝臟，運用試劑盒測定肝糖原含量。

2.4.4乳酸測定

取小鼠48只(第4批)，分組及給藥劑量如2.4.1，在最后一次給藥后30 min，采血20 μL，然后不負重游泳(水溫30 ℃)10 min后，采血20 μL，試劑盒測定乳酸含量，并計算游泳前后乳酸升高百分比。

2 結 果

2.1 復方五味子口服液的制備工藝研究

2.1.1標準曲線的繪制

以不同濃度的葡萄糖對照品溶液濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，計算出濃度和吸光值之間的線性關系。回歸方程為Y=2.127 4x+0.009 9，R2=0.999 7，用于進行多糖含量的計算。

2.1.2單因素實驗結果

實驗結果顯示，當料液(g∶mL)比為1∶30時，多糖得率達到最大值，故選擇1∶20、1∶30、1∶40作為下一步的正交試驗的因素水平；多糖得率在提取時間為4 h時最大，所以選擇3、4、5 h作為正交試驗的因素水平；提取液中多糖的含量隨著溫度的升高而升高，提取溫度大于80 ℃后多糖得率升高變緩，選擇70、80、90 ℃作為正交實驗的因數水平；提取次數為3次時，多糖得率最高，選擇2次、3次、4次作為正交試驗的因素水平。

2.1.3正交試驗結果

根據表2中正交試驗結果及極差分析可知(A:料液比，B:提取時間，C:提取溫度，D:提取次數)，因素A中k2>k3>k1，因素B中k1>k3>k2,因素C中k3>k1>k2,因素D中k2>k3>k1,但R值A>C>D>B，可知各因素對提取液中多糖的影響由大到小依次為料液比、提取溫度、提取次數、提取時間。最佳因素的水平組合為A3B1C3D2，即料液比1∶40，提取時間3 h，提取溫度90 ℃，提取次數3次。總多糖平均含量為20.84%。

表 2 正交試驗結果

2.2 復方五味子口服液對小鼠力竭游泳時間、血清尿素氮、肝糖原和乳酸的影響

如圖1所示，與對照組小鼠相比較，復方五味子口服液各劑量組均能夠明顯增加小鼠竭力游泳時間增加(P<0.05或P<0.01)和肝糖原含量(P<0.05或P<0.01)，并能顯著降低小鼠血清尿素氮水平(P<0.05或P<0.01)和血清乳酸生成百分比(P<0.05或P<0.01)。

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

圖 1 復方五味子口服液對小鼠力竭游泳時間(A)、血清尿素氮(B)、肝糖原(C)和乳酸(D)的影響

3 討 論

抗疲勞效果可通過運動耐量的增加去測量。強迫游泳運動是最常用的行為動物模型之一，已被廣泛用于評估新化合物的抗疲勞特性[3]。血清尿素氮是蛋白質代謝的終產物，也是體內蛋白質代謝的指標。在休息時，血清尿素氮的產生和排泄處于平衡狀態，而在竭力游泳后，血清尿素氮明顯增加[4]。體內尿素氮與運動耐量之間存在正相關關系[5]。乳酸是厭氧條件下碳水化合物的糖酵解產物，糖酵解是在短時間內進行劇烈運動的主要能量來源[6]。許多研究表明，游泳到疲憊導致血乳酸水平顯著升高，乳酸在血液中積聚的速度與游泳時間成反比關系[7]。肝糖原耗竭可能是疲勞發展的重要因素，因為運動過程中肝糖原耗盡，無法維持血糖水平，隨之而來的低血糖可導致神經功能受損[8]。因此，糖原儲存直接影響運動能力和增加糖原儲存,有助于提高耐力和運動能力[9]。

近年來，大量研究表明了五味子[10]、黃芪[11]和覆盆子[12]的抗疲勞作用。而從中醫藥理論來看，五味子補肺益氣，黃芪健脾助陽，覆盆子滋腎填精，三者通過調理肺、脾、腎三臟，達到氣、血、精三者協同共補，共同發揮抗疲勞的作用。因此本課題組以五味子、黃芪和覆盆子為原料，選用人們最愿意接受的口服液制劑形式，制成復方五味子口服液。經過單因素及正交試驗確定最優提取方法為料液比1∶40、提取時間3 h、提取溫度90 ℃、提取次數3次，制成的口服液澄清透明、狀態均勻、口感酸甜。通過動物實驗證實其可以提高小鼠的負重游泳時間和體內肝糖原的含量，降低血清尿素氮和血乳酸的水平，有助于提高小鼠的運動能力和運動后的恢復，是一種值得推薦并具有廣闊發展前景的功能保健食品。