水蚤分子生態毒理學研究進展

鞏寧，孟紫強，邵魁雙，孫野青

1. 大連海事大學環境科學與工程學院，環境系統生物學研究所，大連 116024 2. 山西大學環境科學研究所，山西大學環境醫學與毒理學研究所，太原 030006 3. 國家海洋環境監測中心，大連 116023

分子生態毒理學是采用現代分子生物學方法與技術研究環境化學污染物及其代謝產物與生物大分子(包括核酸、酶和蛋白質)相互作用的一門學科，其目的是找出污染物作用的靶位或靶分子并揭示其作用機理，從而對其在個體、種群或生態系統水平上的影響作出預報。近年來，隨著組學技術的發展，人們逐漸認識到由毒物所導致的生物個體表型變化通常是由于基因表達網絡、多個細胞生物效應的綜合結果，并非單一基因功能的改變所致。因此，一種或多種組學技術(包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學和表觀遺傳組學等)被引入生態毒理學研究中，發展成為“分子生態毒理學”，即通過對一整套基因或蛋白質表達的研究來探討污染物的生態毒性作用，進而為生態風險評估服務[1]。

水蚤(water flea)是隸屬于節肢動物門甲殼綱的浮游動物。其中，枝角目水蚤是一類小型低等甲殼動物，通稱水溞或溞類，俗稱紅蟲。它們廣泛分布在從極地到溫帶以及高山水體中，是初級生產者和高營養級消費者之間的重要中間紐帶，在水生生態系統中具有重要地位。由于溞類對污染物敏感，所以在各種環境壓力下，表現出生殖力下降、活動抑制等行為異常，這也使其成為水生毒理學研究中常用的模式生物。世界經濟合作與發展組織(OECD)據此建立起針對溞類的標準毒性測試方法(OECD Test Guideline 202, 211)[2-3]，該方法已廣泛應用于一些重要物種的毒理學測試，例如，大型蚤[4](Daphniamagna)，中文名又稱“大型溞”；蚤狀蚤[5](D.pulex)，中文名又稱“蚤狀溞”和長刺蚤[6](D.longispina)，中文名又稱“長刺溞”。近年來，溞類生態學、毒理學和生理學平臺的建立，特別是基因組序列的獲得(http://wfleabase.org/)使得研究者們可以通過遺傳學研究工具，如基因連鎖圖譜、cDNA文庫、微陣列、轉錄組測序技術和代謝組學分析技術，對溞類生態毒理學效應進行分析[7-9]。

除了枝角目水蚤，甲殼綱其他種屬的水生生物(包括淡水種和海水種)也在水生生態毒理學研究中廣泛應用，如橈足亞綱哲水蚤目的太平洋真寬水蚤(Eurytemorapacifica)[10]和飛馬哲水蚤(Calanusfinmarchicus)[11]，猛水蚤目的日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)[12]等。本文以枝角目水溞為主要綜述對象，對其他種類的水蚤也略有涉及。為敘述方便，下文統稱其為水蚤。

本文從分子生態毒理學角度，綜述了近年來以水蚤作為受試生物的毒理學研究進展。生態毒理基因組學方法的應用，使我們能夠尋找有害表型結局與特定基因功能之間的聯系以探討水生生態毒理學作用機制，并試圖開發出有效的生物(生態)標志物。

1 基因組學研究(Genomics research)

DNA微陣列(DNA microarray)又稱DNA陣列或DNA芯片，是一塊在數平方厘米面積上安裝數千或數萬個核酸探針涂層的特殊玻璃片。經由一次測驗，即可提供大量基因序列相關信息，是基因組學和遺傳學研究的重要工具。目前，已有多個物種的商業化芯片用于水生毒理學研究[13-15]。由于全基因組序列的獲得，大型溞和蚤狀溞作為受試物種在多種污染物暴露下得到了廣泛的研究。

1.1 金屬及金屬納米材料

在金屬生態毒理學研究方面，Poynton等[16]采用商業化的cDNA芯片進行研究，在亞致死暴露濃度下，鑒定了銅(Cu)、鎘(Cd)和鋅(Zn) 3種金屬的基因表達譜，發現不同金屬對大型溞的暴露可引起不同的表達模式，金屬Zn對幾丁質酶的活性產生了抑制，從中鑒定出金屬硫蛋白和鐵蛋白可作為備選生物標志物。這項研究為生態毒理基因組學的實用性提供了實驗支持。同時，Poynton等[17]還將實驗室暴露獲得的表達譜數據用于野外樣品重金屬污染的預測。利用上述cDNA芯片，將野外樣本的基因表達譜與之前建立的Cu、Cd和Zn的表達譜進行了比較，發現來自含Cu的野外樣品的表達譜與實驗室暴露的Cu的特異性基因表達譜聚類，野外樣品的表達譜中包括了之前鑒定為Cu生物標志物的基因，證明基因表達分析可以用來預測特定的環境污染物。此外，他們的研究還表明，含有不可檢測水平的Cu的野外樣品僅導致少數基因的差異表達，從而在轉錄效應上提出了無觀察毒性效應水平(NOTEL)的概念。該作者認為，這一概念可在區分污染區和非污染區方面發揮重要作用。在金屬納米材料方面，大型溞被分別暴露于納米銀(AgNPs)和硝酸銀(AgNO3)中，通過15k寡核苷酸芯片分析，發現二者表現出不同的表達模式。AgNPs影響水蚤蛋白代謝和信號轉導過程，而AgNO3則導致發育過程的下調，特別是抑制了與感覺發育過程相關基因的表達，說明二者具有不同的作用靶點和毒性作用機制。Poynton等[18]還開發了2種特異性生物標志物用于AgNPs的環境檢測。

1.2 農藥、殺菌劑和藥物

基于抑制差減雜交-聚合酶鏈式反應(suppression subtractive hybridization-polymerase chain reaction, SSH-PCR)技術，Soetaert等[19]開發了大型溞的第一代cDNA芯片(包含855個生活周期特異性cDNAs)，成功地用于對農藥丙環唑(propiconazole)毒性作用機制的研究。大型溞經過1 μg·mL-1丙環唑暴露4 d后，其卵黃蛋白原基因被抑制，卵母細胞的成熟受到了影響。因而可知，卵黃蛋白原mRNA表達水平可作為農藥對水生無脊椎動物慢性生殖影響的早期生物標志物。

基于大型溞的表達序列標簽(ESTs)數據庫，Watanabe等[20]開發了一種具有高重現性的寡核苷酸DNA微陣列，用于評估包括五氯苯酚和β-萘黃酮在內的不同污染物暴露下幼溞的基因表達差異。結果表明，當暴露于不同污染物時，幼溞表現出不同的轉錄模式。這種基因表達的特征模式被認為是具有化學特異性的(chemical-specific)，因此，這種水蚤的DNA芯片可被用來進行水環境化學污染物的分類，其作用模式也有助于人們對常見淡水生物毒性機制的探討。

布洛芬是一種非甾類抗炎藥物，研究者們利用cDNA芯片和生物表型相結合的研究方法，將布洛芬暴露下大型溞的轉錄模式與表型特征相結合，發現布洛芬可能在分子水平、個體水平及種群水平上影響水蚤的繁殖能力[21]。在布洛芬急性暴露條件下，水蚤多個關鍵基因發生了變化。例如，三酰基甘油脂肪酶(triacylglycerollipase,Lip)、白三烯B4-12-羥基脫氫酶(leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase,Ltb4dh)、脂肪酸結合蛋白3(fatty acid binding protein 3,FABP3)、卵黃蛋白原1(vitellogenin 1,DmagVTG1)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)、卵黃外層膜蛋白1(vitelline outer layer membrane protein 1,VMO1)和幾丁質酶(chitinase,Cht)等基因的表達發生上調或下調的變化，表明細胞的代謝過程受到了誘導或抑制。其中，Lip和Ltb4dh基因與類花生酸代謝有關，在無脊椎動物的免疫系統中具有關鍵作用。而FABP3基因則與水蚤內分泌系統中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)信號通路的激活有關。Cht是凋亡過程中分泌的蛻皮液(ecdysial fluid, moulting fluid)中的關鍵酶，其基因的表達與水蚤的生長發育有關；JHE、DmagVTG1和VMO1則是水蚤中與卵子發育相關的酶，它們的基因在水蚤卵子發育的不同階段被表達。這些基因表達的變化可作為布洛芬暴露的潛在生物標志物。

1.3 環境激素類化合物

環境激素類化合物是否影響水蚤性別的分化，一直是生態毒理學家們關心的問題。眾所周知，水蚤中的2類激素(保幼激素和蛻皮激素)在水蚤的性別決定中起著關鍵作用。2002年，Olmstead和LeBlanc[22]首次報道了類倍半萜烯激素——甲基法尼酯(methyl farnesoate, MF)誘導雄性大型溞出現的作用，它是昆蟲保幼激素Ⅲ的未環化形式。除此之外，研究發現，其他保幼激素的類似物也有誘導雄性水蚤產生的作用，如殺蟲劑蚊蠅醚(pyriproxyfen)、苯氧威(fenoxycarb)和甲基普林(methoprene)。有趣的是，所有上述的化合物同時還誘導了水蚤中血紅蛋白(hemoglobin, Hb)的合成。因此，雄性產生與Hb誘導這2個過程似乎可以通過保幼激素的信號轉導相偶聯。Olmstead和LeBlanc[22]的研究還表明，在大型溞和蚤狀溞中，MF刺激雄性個體的出現呈現劑量依賴效應，>300 nmol·L-1的MF導致所有水蚤均為雄性。通過基因芯片分析，Eads等[23]發現，與對照組相比，MF處理組的水蚤有39個上調基因和16個下調基因。他們鑒定出了22個差異表達的基因。其中，神經元乙酰膽堿受體、精氨酸激酶、淀粉酶、細胞色素c氧化酶和細胞色素b以及一些角質蛋白、肌動蛋白、核糖體生物合成調控蛋白等基因表達上調。

雙酚A(BPA)的生態毒理效應近年來受到了廣泛關注。利用cDNA芯片分析方法，Jeong等[24]研究了BPA在水蚤繁殖、發育及個體行為中的影響。21 d繁殖抑制測試表明10 mg·L-1的BPA顯著影響了大型溞的繁殖能力。一些候選基因，包括角質層蛋白、卵黃蛋白原、蛋白酶和核糖體蛋白等的表達水平有顯著變化。這些基因可能成為BPA暴露的生物標志物。

2 轉錄組學研究(Transcriptomics research)

隨著高通量測序(high-throughput sequencing)平臺的相繼出現，基于新一代測序技術的轉錄組測序(RNA-seq)成為大規模研究轉錄組的一種新的且更為有效的方法[25]。RNA-seq是直接對cDNA序列進行測序，產生數以萬計的reads數量，從而使得一段特殊的基因組區域的轉錄水平可以直接通過比對到該基因組區域的reads數來衡量。在水生分子毒理學領域，越來越多的研究者們利用該技術進行污染物的毒性機制分析，試圖找到基因表達與環境變化之間的關系[26-30]。

2.1 重金屬

Orsini等[31]利用RNA-seq對包括不同濃度重金屬Cd、Pb暴露在內的12種環境壓力下大型溞的轉錄組數據進行了分析。他們選擇了3個基因型的大型溞群體，其中2個為近交系，另一個為該近交系的重組體。對每一個基因型的每一種暴露均提取5個生物學重復的RNA樣本，并從這5個生物學重復中挑選3個高質量的RNA用于后續的高通量測序，進而獲得了多套轉錄組數據。結合大型溞的參考(對照)基因組和基因圖譜，他們將獲得的大型溞環境基因組信息上傳到水蚤基因組數據庫中(wFleaBase.org)。利用該數據庫，可對差異表達的基因進行功能注釋，進而對環境壓力下遺傳適應性和表型可塑性對壓力反應的相對貢獻做出評估。由此可知，水蚤由于具有豐富的生態數據而成為一個很好的研究模型。

2.2 藥物

近來，Russo等[32]探討了水環境中存在的3種抗癌藥物伊馬替尼(imatinib mesylate, IMA)、順鉑(cisplatinum, CDDP)和依托泊苷(etoposide, ETP)對大型溞的影響。他們將幼溞分別暴露在能夠引起DNA損傷的低濃度藥物中(IMA: 2 000 ng·L-1, ETP: 300 ng·L-1, CDDP: 10 ng·L-1)，利用RNA-seq技術一共獲得了14 000 000個reads，發現3種藥物均引起了血管緊張素轉化酶樣基因(angiotensin converting enzyme-like gene,ance)的下調，而ETP還引起了DNA拓撲異構酶Ⅱ基因(DNA topoisomerase Ⅱ)的下調。GO(Gene Ontology)富集分析的結果表明，ETP和IMA引起的DNA損傷干擾了細胞周期調控和G-蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptor, GPCR)信號轉導過程。這種失調可能會影響水蚤神經系統的發育，甚至整個個體的生長和發育。這一工作的意義在于，他們以水蚤作為受試生物，探討了藥物對非靶向生物的影響，深入了解了抗癌藥物暴露引起的DNA損傷機制，并對這些化學物質如何影響這一重要浮游動物物種的生長和生存提出了新的假設。

2.3 有毒藻毒素

作為水生生態系統中的初級消費者，水蚤等浮游動物對控制水體中微藻的數量、抑制有害水華具有重要作用。同時，有毒藻毒素也可通過水蚤向上一營養級傳遞，甚至危害到人類的健康。一般來講，藻毒素不會造成浮游動物的死亡，但是否對其基因表達乃至代謝活動產生影響，進而在種群或群落水平上產生毒性效應，乃是生態毒理學家們關心的問題。RNA-Seq技術的轉錄組分析已經成為揭示浮游動物耐受藻毒素分子機制的有利工具。為了排除攝食的影響，Schwarzenberger等[33]用分泌微囊藻毒素的藍藻及其變異的工程菌株(不分泌藻毒素)分別投喂大型溞。通過RNA-Seq技術識別出水蚤基因組中應對微囊藻毒素脅迫的候選基因，發現ABC家族的一些轉運蛋白可能起到了基因調控的作用。為探討貝毒的影響，Roncalli等[11]以橈足類浮游動物飛馬哲水蚤(C.finmarchicus)為受試生物，研究了喂食不同時間的亞歷山大藻(Alexandriumfundyense)后，水蚤轉錄譜的變化，發現經過5 d的喂食，一些與能量代謝相關的基因表達下調，表明石房蛤毒素(saxitoxin)影響了水蚤的能量分配。與預想結果不同的是，一些與解毒相關的基因(如GSTs和CYP450)并沒有明顯的上調，而一些與消化相關的基因表達(如胰蛋白酶)卻發生了變化。同時，與生物合成、生長及繁殖相關的基因明顯下調。這些結果表明，雖然水蚤表現出了對亞歷山大藻極強的耐受性(無死亡現象)，但它們的生理活動及繁殖能力已經受到了影響。由此推測，當亞歷山大藻赤潮爆發的時候，水蚤的種群增長可能會受到影響。

3 蛋白質組學研究(Proteomics research)

迄今為止，蛋白質組學技術已成為應用于生態系統評估的組學方法中使用第二廣泛的方法[1]。與轉錄組水平上的生態毒理學研究相比，基于蛋白質組分析的研究更偏重于指紋圖譜(即蛋白表達譜)的識別。這項研究通常基于2種主要的技術。一是基于SELDI質譜(也被稱為retentate chromatography-mass spectrometry, RC-MS)的蛋白質指紋識別方法，二是基于雙向電泳(2-DE)和MALDI-MS(matrix-assisted laser deionization)的肽段指紋識別。例如，Le等[34]利用2-DE技術研究了單一或復合重金屬(三價砷、五價砷和鎘)污染對大型溞的影響。他們鑒定出了117個發生變化的蛋白，可用于作為水生態系統重金屬污染的蛋白標志物。與單一金屬作用的蛋白表達模式相比，2種重金屬混合物的暴露表現出了復雜的分子間相互作用，其蛋白表達模式并不是2種單一金屬的模式迭加。將大型溞暴露于檸檬酸鹽包被的納米銀和硝酸銀溶液中，對其個體水平的毒性效應及分子機制進行了分析，發現2組的卵黃蛋白原水平均有上升，但納米銀暴露組的血紅蛋白水平升高，而硝酸銀暴露組的調控蛋白的羰基化水平降低，表明2種銀暴露對水蚤的生物途徑有明顯影響，從而可能導致大型溞與水環境化學污染物發生不同的相互作用[35]。這一結果與前述在轉錄組水平的研究均說明納米顆粒的毒性作用具有其獨特性[18]。

如前所述，藍藻水華會對水蚤產生影響。其中部分原因在于藍藻次級代謝產物(如蛋白酶抑制劑)對水蚤消化系統的抑制作用。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)分析，Schwarzenberger等[36]在大型溞中發現并鑒定出了9種不同的蛋白酶。他們認為，水蚤通過上調相應蛋白酶的表達來對食物中的蛋白酶抑制劑做出響應。其中，胰蛋白酶和糜蛋白酶上調了1.4倍至25.6倍，并且他們證明水蚤的這種反應與前述微囊藻毒素的作用是無關的。

4 代謝組學研究(Metabonomics research)

與基因組學和轉錄組學技術相比，代謝組學技術在生態毒理學研究中應用較晚。這一研究手段主要基于核磁共振技術(NMR)及生物體內代謝物的質譜分析。與蛋白質組學研究類似，大多數的生態代謝組學研究都集中在探討在實驗室或野外環境中，暴露于不同類型環境化學污染物的生物體內所觀察到的不同代謝特征。直接輸注傅里葉變換離子回旋共振質譜(DI FT-ICR MS)技術是一種高通量、超高分辨率的方法，常被代謝組學研究所使用。Taylor等[37-38]采用FT-ICR MS方法，研究了重金屬Cu對大型溞的急性代謝組學效應及其毒性模式。Poynton等[39]將代謝組學技術與轉錄組學技術相結合，通過GO(Gene Ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路分析，發現在24 h亞致死濃度的鎘暴露下大型溞的營養攝入及代謝受到干擾，導致能量合成抑制，從而引起慢性毒性效應。另外一項基于1H-NMR技術的代謝組學研究，利用主成分分析(principal component analysis, PCA)的方法研究砷、銅和鋰對大型溞暴露48 h所引起的亞致死效應。結果表明，鋰和銅表現出類似的代謝模式，二者都是通過干擾能量儲存及調控而產生毒性效應，而砷暴露引起的代謝改變與對照組相比無顯著性差異[40]。Taylor等[41]采用OECD 21 d繁殖試驗方法，測試鎘、2,4-二硝基苯酚和普萘洛爾3種水環境污染物對大型溞的生殖毒性，結合質譜法測量這些實驗動物的代謝變化特征，從而發現了潛在的生物標志物并用來預測3種化學物質的生殖毒性。雖然這些發現的適用性僅限于3種化學物質，但對水蚤慢性適應性的早期反應代謝生物標志物的研究具有重要參考價值。

5 表觀遺傳組學研究(Epigenomics research)

表觀遺傳學(epigenetics)是指基于非基因序列改變所致的基因表達水平的變化，如DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA干擾等；而表觀基因組學則是在基因組水平上對表觀遺傳學改變的研究。目前的研究已表明，表觀遺傳學標志物可受多種環境因素的影響。Vandegehuchte等[42]利用超高效液相色譜(UPLC)和基因芯片技術，對大型溞暴露于多種環境化學污染物后其DNA甲基化水平及轉錄譜進行研究。結果表明，全基因組及局部DNA的甲基化水平可被5-氮胞苷(5-azacytidine)、農利靈(vinclozolin)、染料木黃銅(genistein)及鋅(zinc)所改變；而5-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine)、雙酚A(bisphenol A)和鎘(cadmium)則不能影響其DNA甲基化水平。近年來組學分析還發現，環境毒物的暴露可引起水蚤多種與生長發育相關的基因發生表觀遺傳學改變。例如，利用亞硫酸鹽測序技術(bisulfite sequencing)、甲基化DNA免疫共沉淀技術(methylated DNA immunoprecipitation)等對DNA甲基化的研究發現，在環境毒物的暴露下，水蚤的體長、產卵量和性別分化等受到影響，而相應的水蚤生長和繁殖相關基因的DNA甲基化也發生異常改變[43]。

環境污染物的代際傳遞是生態毒理學家們關注的環境問題。研究表明，瞬時化學暴露的影響可以通過表觀遺傳轉移到非暴露的世代。如果這是一個普遍的現象，它可能會對當前的生態風險評估產生重大影響。Vandegehuchte等[44]利用優化的LC-MS/MS方法，通過測定5-甲基-2’-脫氧胞苷(5mdC)總含量對鋅暴露下大型溞的DNA甲基化水平進行了定量，并評估了Zn暴露對跨代5mdC含量的影響。結果表明，親代Zn暴露后的F1代水蚤DNA甲基化水平出現顯著的降低。但這種效應并沒有延續到下一代(F2代)中。這一發現為進一步研究表觀遺傳學在水生毒理學中的作用開辟了道路。

綜上，將水蚤組學研究的主要方法及相關污染物類型總結于表1中。

6 展望(Prospects)

由于水蚤具有生長繁殖快、分布范圍廣和對環境變化敏感等特點，已成為廣泛應用的模式生物，從而為多種環境污染物的生態毒理學研究提供了有利工具。同時，在水蚤生態毒理學研究中，組學技術和指紋識別方法的應用和發展，也為生態風險評估提供了重要的理論和技術支撐。作為一門新興學科，水蚤分子毒理基因組學需要依賴于高通量、高分辨率的分析技術與完整的生物信息學系統，到目前為止仍存在很多挑戰。首先，如何將常規的毒理學分析結果與組學數據相結合，通過考察不同污染物暴露下水蚤的基因及蛋白表達、以及內源性代謝物的動態變化規律，對污染物的毒性作用靶點和關鍵信號通路進行定性分析，以揭示毒物對水蚤的作用及損害機制；其次，多組學技術是一種強有力的工具，其高通量篩選特征為研究外界干擾對生物體的刺激提供新的視角，成為毒理學發展的新趨勢。目前在水蚤中，僅有少數物種獲得了全基因組序列，缺乏蛋白和內源代謝物的信息。如何基于多組學技術(如轉錄組和蛋白質組、轉錄組和代謝組等)，探討不同污染物對水蚤的毒性作用機制，并對生物標志物進行分析和篩查，是水蚤多組學研究面臨的問題；第三，利用水蚤孤雌生殖的特性，通過表觀遺傳組學技術，對污染物的代際傳遞效應進行分析，進而從種群水平對污染物的生態風險進行評估，還需要大量的數據積累與分析。

表1 水蚤組學研究的主要方法及相關污染物類型Table 1 Main research methods and related pollutant types in omics study of water flea