環境劑量磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯多代暴露對斑馬魚子代仔魚的神經發育毒性

丁希勝，馬徐發,2,#，余麗琴,2,*

1. 華中農業大學水產學院，武漢 430070 2. 湖北省池塘養殖工程實驗室，武漢 430070

有機磷阻燃劑被廣泛添加在電子設備、紡織品和家具等日常用品中，用于避免易燃物被引燃和延遲火災的蔓延[1-2]。作為主要的有機磷阻燃劑，磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)通常添加在家具、兒童泡沫玩具和汽車裝潢物中[3]。作為一種新型的環境污染物，在地表水、自來水、室內空氣和水生生物體中，甚至人體代謝物中都有一定濃度的TDCIPP被檢出[4-5]。據報道，國內松花江水樣中TDCIPP濃度范圍是2.5～40 ng·L-1[6-7]。在我國青島、廈門和連云港附近水域采集的水樣中，TDCIPP的最高濃度達377 ng·L-1[8]。我國南京市10個自來水廠水樣中TDCIPP的平均含量為8.5 ng·L-1[9]。在我國珠江三角洲區域生活的淡水魚肌肉中TDCIPP的蓄積量達到251 μg·kg-1[10]。

近年來，大量的離體和活體實驗研究都表明了TDCIPP具有神經毒性。例如，離體實驗結果表明，TDCIPP暴露降低了細胞的活力，提高了多種類型神經細胞的凋亡率[11-13]，并干擾大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)的細胞分化和細胞遷移[13]。一項活體研究表明，TDCIPP暴露導致稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)成魚體內的神經營養因子及其受體的基因表達顯著性降低[14]。在斑馬魚中，TDCIPP暴露可降低神經遞質(例如血清素和多巴胺)的水平，下調成魚和母體暴露后產下的子代仔魚(受精后5 d，5-day post-fertilization，5 dpf)中神經發育相關基因的表達，包括髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,mbp)和突觸素Ⅱ(synapsin Ⅱa,syn2a)[15-16]。早期生命階段的研究表明，TDCIPP急性暴露會引起魚類顯著的行為改變，特別是仔魚游泳活動[17-21]，推測魚類游泳行為的變化可能是TDCIPP暴露的敏感終點。但是，這些研究均是基于較高劑量的暴露實驗，有關環境劑量TDCIPP對魚類游泳行為的影響尚未知。此外，生物體在自然生態系統中往往長達多代都暴露于環境污染物中。所以，有必要研究環境劑量TDCIPP多代暴露對斑馬魚子代仔魚神經發育的影響。

在斑馬魚中，一些與胚胎/仔魚神經發育相關的候選基因可以作為評價化合物神經發育毒性的生物標志物[22]。其中，神經元特異性RNA結合蛋白(ELAV like neuron-specific RNA binding protein 3,elavl3)和神經原素1 (neurogenin-related gene 1,ngn1)是神經元發育的標志基因[23-24]。α1微管蛋白(α1-tubulin)基因在神經元軸突和樹突的發育和再生中起著非常重要的作用[25]，生長相關蛋白(growth associated protein 43,gap43)基因在神經元中軸突再生和發育時高表達[26]，神經生長因子(netrins)基因可以刺激斑馬魚胚胎中神經元軸突的生長[27]，zn5是第二運動神經元軸突的標志基因[28-29]。音猬基因(shha)的功能主要是連接視網膜神經調節細胞與脊髓軸突間的軸突索[30-31]。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是一種中間絲蛋白，在中樞神經系統的星形膠質細胞和放射狀神經膠質細胞中高度表達，被作為星形膠質細胞的標志物[32]。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)是斑馬魚正在發育的中樞神經系統中軸突的髓鞘形成所必需的[33]。

本文以斑馬魚為研究模型，將3代斑馬魚暴露于環境劑量的TDCIPP，評價每一代的子代仔魚生長發育以及運動行為所受到的影響，并考察神經發育標志基因的表達變化，分析其與行為變化的相關性，探討影響行為的可能原因，評價TDCIPP多代暴露對其子代仔魚神經發育的毒性效應，研究結果對全面評價TDCIPP的環境和人類健康風險具有重要的參考意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑

磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)純度>95%，購自東京化成工業株式會社(東京，日本)。用于儲存和稀釋TDCIPP的二甲基亞砜(DMSO)純度>99%，間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)純度98%，二者均購自Sigma-Aldrich公司(密西根州圣路易斯，美國)。Trizol試劑、PrimeScript?RT reagent試劑盒和SYBR?Real-Time PCR Master購自TaKaRa公司(大連，中國)。氯仿、異戊醇和無水乙醇均為國產分析純。

1.2 斑馬魚飼養及TDCIPP暴露實驗

實驗所用AB純系斑馬魚的養殖以及暴露實驗根據Yu等[34]提供的實驗方案實施。斑馬魚胚胎(野生型AB品系)購于中國科學院水生生物研究所。挑選發育正常的囊胚期胚胎(受精后2 h，2 hpf)，隨機分配至含有0、3、30和300 ng·L-1TDCIPP暴露液的培養皿中，每個皿中放置100顆胚胎，每個濃度設置3個平行，所有暴露組DMSO濃度為0.001% (V/V)。將培養皿置于光照培養箱中培養，5 d后將孵化出的仔魚從培養皿中轉移到魚房中25 L的魚缸內，每隔2天全部更換一次暴露液。控制水溫穩定在(28±0.5) ℃，光照控制為14 h光照∶10 h黑暗，每日投喂2次豐年蟲。實驗中所投喂的豐年蟲均于實驗室中孵化，豐年蟲卵從天津豐年水產養殖有限公司購得。從F0胚胎開始暴露，持續暴露3代(F0代、F1代和F2代)，每一代暴露120 d，然后以1∶1的比例將雄魚和雌魚混在一起產卵，收集每一代的子代(F1代、F2代和F3代)，于暴露液中持續培養至5 dpf，統計F1代、F2代和F3代胚胎/仔魚3 dpf的孵化率、5 dpf的存活率、5 dpf的畸形率和5 dpf的體長。

1.3 斑馬魚仔魚運動行為分析

斑馬魚仔魚的游泳行為的檢測參照筆者之前的實驗方法[20]。簡單的說，針對每一代斑馬魚仔魚(F1代、F2代和F3代)，每個濃度每個平行缸取8尾仔魚進行游泳行為測定，采用ZebraLab行為圖像監測器中Video-Track系統(View Point Life Sciences，蒙特利爾，加拿大)中的攝像頭記錄仔魚運動軌跡，從而分析獲得相關行為數據，定量分析5 dpf仔魚的游泳行為。測定之前，先將斑馬魚放入裝有TDCIPP暴露液的12孔板中適應10 min，調節水溫保持在(28±0.5) ℃，每個孔中一條仔魚；然后進行40 min的光暗交替(5 min光照—5 min黑暗—5 min光照—5 min黑暗)刺激，每30秒采集一次仔魚運動頻率、行進距離和運動持續時間，試驗中保持安靜的環境。記錄的數據用在線Open Office.Org 2.4軟件分析。

1.4 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)

斑馬魚仔魚的神經發育相關基因的檢測參照筆者之前的實驗方法[35]。對F1代、F2代和F3代120 hpf的斑馬魚仔魚進行神經相關基因表達分析。每個平行缸隨機取50尾仔魚(n=3)置于Trizol中，根據筆者之前的方法[33]進行總RNA的提取，采用分光光度計檢測260/280比值來確定cDNA的合成。使用在線引物設計軟件Primer 3 software (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)進行設計，引物序列如表1所示。

1.5 數據分析方法

實驗數據采用SPSS 13.0軟件(SPSS, Chicago, IL, USA)處理分析。首先采用Kolmogorov-Smirnov方法對數據進行正態分布檢驗，對不符合正態分布的數據進行轉換使其符合正態分布。然后采用Levene’檢驗方法進行數據的方差齊性檢驗。暴露組和對照組采用單因素方差分析方法(one-way analysis of variance, ANOVA)中Tukey’s多重比較法進行數據的差異性檢驗。結果表示為3次獨立重復試驗數據的算術平均值±標準差(mean±SD)。使用Spearman相關分析來檢驗仔魚在光暗刺激下的平均游泳速度和神經發育相關基因表達之間的相關性，P<0.05為顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 TDCIPP多代暴露對各自子代5 dpf仔魚存活率和孵化率的影響

如表2所示，與對照組相比，經環境劑量的TDCIPP (300 ng·L-1)暴露后，F0代斑馬魚的子代F1代的孵化率顯著性降低(P<0.05)，5 dpf子代的存活率也顯著性下降(P<0.01)(表2)，但其畸形率和體長無顯著性變化。隨著暴露代數的增加，與對照組相比，F2代和F3代仔魚的生長、存活率以及畸形率均無顯著性差異(表2)。

2.2 TDCIPP多代暴露對各自子代5 dpf仔魚神經行為的影響

如圖1所示，在光暗周期刺激下，與對照組相比，在初始黑暗狀態下300 ng·L-1TDCIPP暴露組中F0代斑馬魚120 d后所產子代F1代仔魚的游泳速度顯著性降低(P<0.05)；在處于光照環境中時，3和300 ng·L-1TDCIPP暴露組仔魚的游泳速度均顯著性下降(P<0.05、P<0.05)；當環境再次處于黑暗周期時，最高劑量(300 ng·L-1)暴露導致子代仔魚的游泳速度顯著性下降(P<0.05)。

表1 研究中的目的基因與引物序列Table 1 Genes and primers used in this study

表2 環境劑量磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCIPP)多代暴露對F1代、F2代和F3代斑馬魚胚胎/仔魚的孵化率、畸形率、成活率和體長的影響Table 2 Effects of multigenerational exposure to tris (1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCIPP) at environmental concertation on the hatching rate, survival rate, malformation rate and body length of F1, F2 or F3 embryos/larvae

注：數據表示為平均值±標準差(mean±SD)，每個濃度3個平行樣，每個平行樣50條胚胎或仔魚。*P<0.05、**P<0.01表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。

Note: The data are expressed as mean ±SD of three replicates (50 embryos/larvae per replicate); *P<0.05, **P<0.01 indicate significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

如圖2所示，與對照組相比，300 ng·L-1TDCIPP暴露組中F1代120 d后所產子代F2代的游泳速度在黑暗刺激下顯著性降低(P<0.05)，在光照周期下無顯著性差異。

如圖3所示，與對照組相比，3、30和300 ng·L-1TDCIPP暴露組中F2代120 d后所產子代F3代的游泳速度在黑暗和光照刺激下均無顯著性變化。

2.3 TDCIPP多代暴露對各自子代5 dpf仔魚神經發育相關基因表達的影響

檢測了F1代、F2代和F3代5 dpf仔魚在TDCIPP暴露下神經細胞生長發育及分化相關的幾種基因的相對表達量(圖4)。如圖4(a)，在F1代中，與對照組相比，300 ng·L-1TDCIPP暴露導致神經元標志基因ngn1表達量顯著性升高(P<0.01)，3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致神經元軸突再生和發育相關的基因α1-tubulin顯著性上調(P<0.001、P<0.01)，30 ng·L-1TDCIPP暴露導致刺激軸突生長的netrin1b基因顯著性上調(P<0.05)，3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致運動神經元軸突標志基因zn5顯著性上調(P<0.05，P<0.05)，但星形膠質細胞的標志基因gfap在300 ng·L-1TDCIPP暴露下顯著性下調(P<0.01)。

圖1 F0代斑馬魚暴露于TDCIPP 120 d后對所產F1代5 dpf仔魚運動行為的影響注：(a)光暗周期刺激下斑馬魚仔魚的運動模式，(b)光暗周期刺激下的斑馬魚仔魚在各階段的平均游泳速率；數據表示為平均值±標準差(mean±SD)，每個濃度3個平行樣，每個平行樣8條仔魚；* P<0.05表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。Fig. 1 Locomotor behavior of the 5 dpf larvae of F1 after F0 parental zebrafish exposed to TDCIPP for 120 dNote: (a) locomotor patterns in response to an alternating light change; (b) the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark); the data are expressed as mean±SD of three replicates (8 larvae per replicate); * P<0.05 indicates significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

圖2 F1代斑馬魚暴露于TDCIPP 120 d后對所產F2代5 dpf仔魚運動行為的影響注：(a)光暗周期刺激下斑馬魚仔魚的運動模式，(b)光暗周期刺激下的斑馬魚仔魚在各階段的平均游泳速率；數據表示為平均值±標準差(mean±SD)，每個濃度3個平行樣，每個平行樣8條仔魚；* P<0.05表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。Fig. 2 Locomotor behavior of the 5 dpf larvae of F2 after F1 parental zebrafish exposed to TDCIPP for 120 dNote: (a) locomotor patterns in response to an alternating light change; (b) the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark); the data are expressed as mean±SD of three replicates (8 larvae per replicate); * P<0.05 indicates significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

圖3 F2代斑馬魚暴露于TDCIPP 120 d后對所產F3代5 dpf仔魚運動行為的影響注：(a)光暗周期刺激下斑馬魚仔魚的運動模式，(b)光暗周期刺激下的斑馬魚仔魚在各階段的平均游泳速率；數據表示為平均值±標準差(mean±SD)，每個濃度3個平行樣，每個平行樣8條仔魚。Fig. 3 Locomotor behavior of the 5 dpf larvae of F3 after F2 parental zebrafish exposed to TDCIPP for 120 dNote: (a) locomotor patterns in response to an alternating light change; (b) the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark); the data are expressed as mean±SD of three replicates (8 larvae per replicate).

如圖4(b)所示，在F2代中，與對照組相比，最高劑量TDCIPP (300 ng·L-1)暴露導致神經元標志基因elavl3顯著性下調(P<0.05)，與神經元軸突生長和再生相關的標記基因gap43顯著性下調(P<0.05)，30和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致shha基因顯著性下調(P<0.05、P<0.05)，3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致gfap基因表達量顯著性下調(P<0.05、P<0.05)。但對其他基因的表達均無顯著性影響。

如圖4(c)所示，在F3代中，與對照組比較，300 ng·L-1TDCIPP暴露導致gap43表達量顯著性下降(P<0.05)，3和300 ng·L-1TDCIPP暴露導致gfap基因表達量顯著性下降(P<0.05、P<0.05)，但對其他基因無顯著性影響。

2.4 相關分析

F1代、F2代和F3代5 dpf仔魚神經發育相關基因表達的變化與各自游泳速度變化之間的相關性分析如表3所示。由Spearman相關性分析可知，F1代5 dpf仔魚在光暗刺激下的游泳速度與神經元標記基因ngn1、神經元軸突生長密切相關的基因α1-tubulin和運動神經元標志基因zn5的表達顯著負相關。而F2代和F3代仔魚在光暗刺激下的游泳速度與神經發育相關基因的表達都無顯著相關性。

表3 F1代、F2代和F3代5 dpf仔魚在光暗刺激下的平均游泳速度與神經發育相關基因表達的Spearman rank相關系數Table 3 Spearman rank correlation coefficients between the average swimming speed of 5-min intervals for each light state (light or dark) and the expressions of genes related to neural development in the 5 dpf zebrafish larvae of F1, F2, F3

注：*0.05水平的顯著相關(雙尾)，** 0.01水平的顯著相關(雙尾)。

Note: * correlation is significant at the 0.05 level (two-tailed); ** correlation is significant at the 0.01 level (two-tailed).

圖4 環境劑量TDCIPP多代暴露對斑馬魚F1代(a)、F2代(b)和F3代(c)的5 dpf仔魚神經發育相關基因的影響注：數據表示為平均值±標準差(mean±SD)，每個濃度3個平行樣，每個平行樣50條仔魚；*P<0.05、** P<0.01和*** P<0.001表示暴露組與溶劑對照組相比具有顯著差異。Fig. 4 Expressions of genes related to neural development in 5 dpf zebrafish larvae (F1 generation (a), F2 generation (b), F3 generation (c)) under multigenerational exposure to environmental concentration of TDCIPPNote: The data are expressed as mean±SD of three replicates (50 larvae per replicate); * P<0.05, ** P<0.01 and *** P<0.001 indicate significant difference detected between solvent control and TDCIPP exposure group.

3 討論(Discussion)

TDCIPP作為一種新型污染物，經常在自然水體中檢測到(<μg·L-1)。筆者所在團隊前期的研究結果表明，環境劑量的TDCIPP暴露，會導致TDCIPP在斑馬魚母體內蓄積[36-37]，并會傳遞到子代魚卵中[36]。此外，斑馬魚持續暴露于環境劑量的TDCIPP 2代后，會在第2代斑馬魚成魚體內檢測到其蓄積[38]。目前，這些蓄積的TDCIPP是否會對斑馬魚子代持續產生不利影響還是未知的。早期發育階段對化合物暴露更為敏感，尤其是大腦發育階段[39]，斑馬魚早期發育階段神經系統中專一表達的一些基因已證實可以作為發育神經毒性的生物標志[22]。此外，斑馬魚的游泳行為是在早期發育后期出現的一個較復雜的行為，需要化學遞質傳遞和后腦神經系統的輸出[40]，仔魚的運動行為也可用于指示神經毒性效應[41]。本實驗采用環境劑量TDCIPP對斑馬魚進行3代暴露實驗，探究其對子代斑馬魚仔魚生長發育和神經發育的影響，以此來評估TDCIPP的生態毒性風險效應。

F0代暴露于環境劑量TDCIPP (300 ng·L-1) 120 d后所產子代F1代仔魚的孵化率和成活率均顯著性降低。這與筆者所在團隊前期的研究結果是類似的，斑馬魚暴露于5 000 ng·L-1TDCIPP 240 d導致子代仔魚的存活率下降、體長減小和生長發育受阻[36]。但在后面2代的持續暴露中，F2代和F3代仔魚的孵化率、存活率、畸形率以及體長均未受到顯著性影響，這些結果表明，隨著暴露代數的增加，TDCIPP對子代斑馬魚的發育毒性減弱。

環境劑量TDCIPP多代暴露對子代斑馬魚仔魚F1代和F2代的游泳行為具有顯著抑制作用，但是對F3代的游泳行為無顯著性影響。目前，有關環境劑量TDCIPP多代暴露對生物體影響的研究非常少，而其對神經行為的影響更是鮮有報道。在筆者的實驗中，300 ng·L-1TDCIPP暴露導致F1代仔魚在黑暗刺激下的游泳速度均顯著性下降，暴露于3和300 ng·L-1TDCIPP的F1代仔魚在光照刺激下的行為也顯著性下降。類似的結果在之前的研究中也有報道，Wang等[16]將斑馬魚暴露于100 μg·L-1TDCIPP 3個月后，成魚的運動行為未受到顯著性影響，但所產子代仔魚的平均游泳速率在光照和黑暗下均顯著性下降。此外，筆者所在團隊前期的實驗結果表明，較高劑量TDCIPP (>300 μg·L-1)短期暴露會導致斑馬魚仔魚的游泳行為在最初黑暗適應期的活動有所增加，而在光照時反應有所減弱[20]，而濃度>100 μg·L-1的TDCIPP暴露不會影響仔魚的游泳行為[16,20]。在13 μg·L-1的TDCIPP暴露下，仔魚在最初黑暗適應期的活動有所增加，而逃逸反應有所減弱[42]。而有研究發現，暴露于較高濃度(1.353和2.413 mg·L-1；3和6 μmol·L-1)TDCIPP下，在光照和黑暗2種條件下斑馬魚仔魚的游泳速度均顯著性降低[17,21]。這些研究結果表明，TDCIPP暴露對斑馬魚仔魚的游泳行為具有顯著的干擾效應，且母體TDCIPP暴露后的F1代仔魚比F0代成魚和仔魚都要敏感。對F2代仔魚，300 ng·L-1TDCIPP暴露導致在黑暗下的斑馬魚仔魚游泳速率顯著性下降，但在光照刺激下其運動速度無顯著性變化。但到F3代仔魚時，TDCIPP的持續暴露未引起斑馬魚的游泳行為的顯著性變化。結果表明，環境劑量的TDCIPP暴露會導致F1代仔魚的神經發育毒性，但是TDCIPP持續多代暴露并未導致毒性的增強，反而隨著暴露代數的增加，斑馬魚仔魚對TDCIPP的敏感性呈現降低的趨勢。

有研究表明，斑馬魚運動行為的改變與運動神經元的發育受影響相關[43-44]。為探究TDCIPP可能的神經發育毒性機制，分析了仔魚神經相關基因的轉錄水平，并將其與運動行為進行了相關性分析。在F1代仔魚中，神經元標記基因ngn1表達量顯著性升高，與神經元軸突生長密切相關的基因α1-tubulin、netrin1b和zn5顯著性上調，這些基因表達的上調可能是對神經元軸突損傷的一個補償性反饋。在之前的研究中，α1-tubulin表達量的上調被認為是對化學品暴露后斑馬魚仔魚軸突生長受到的抑制作用的補償性反饋(如得克隆(DP)和2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(BDE-47)暴露實驗)[43-44]。實際上，在筆者所在團隊的前期實驗中也發現，TDCIPP急性暴露會導致運動神經元軸突的損傷，并伴隨著軸突生長相關基因α1-tubulin、netrin表達量的上調[20]。環境劑量TDCIPP暴露主要影響了F1代神經元和軸突生長相關基因的表達，而對神經遞質乙酰膽堿酶活基因(acetylcholinesterase,ache)、髓磷脂堿性蛋白基因(myelin basic protein,mbp)等均無顯著性影響，相關性分析顯示，游泳速度的抑制與ngn1、α1-tubulin、gap43和zn5這4個基因的表達顯著負相關，這些結果表明，TDCIPP可能主要通過影響神經元軸突的生長來導致游泳行為受阻，這與前期的實驗結果類似[20]。在F2代斑馬魚仔魚中，TDCIPP暴露導致神經元標志基因elavl3(編碼HuC)表達量顯著性下調，表明神經發育受到了損傷。生長相關蛋白gap43基因的表達量也顯著性降低，gap43常常用作神經損傷后再生時重新誘導軸突生長的標志[20]，該基因的下調表明受損神經的再生受到了影響。此外，星形膠質細胞標記基因gfap以及連接視網膜和脊髓間的軸突索基因shha均顯著性下降。這些基因表達的下調表明TDCIPP暴露可能對神經元、神經膠質細胞的數量和再生均產生了影響，表現出明顯的神經發育毒性。然而，相關性分析表明，F2代仔魚游泳速度的降低與這些基因表達的下降無顯著相關性，提示TDCIPP可能不是通過影響神經細胞的數量而影響魚的游泳行為。在F3代中，僅gap43和gfap這2個基因的表達量受到TDCIPP暴露的抑制，表明隨著暴露代數的增加，TDCIPP的神經發育毒性在減弱，這與游泳行為以及生長發育的結果是一致的。

綜上所述，環境劑量TDCIPP暴露對斑馬魚子代仔魚具有神經發育毒性，但是隨著暴露代數的增加TDCIPP的毒性效應呈現減弱的趨勢。TDCIPP暴露導致F0代所產F1代仔魚的生長發育以及運動行為受到顯著的抑制，其對運動速度的影響可能主要源于神經元軸突的生長受到了影響，表現為運動行為抑制與神經軸突生長相關基因(ngn1、α1-tubulin和zn5)的表達量顯著負相關。繼續暴露后，F2代仔魚的生長發育不再受到顯著性影響，運動行為僅在最高劑量組黑暗處理下受到抑制，神經發育相關基因(elavl3、gap43、gfap和shha)表達量顯著下降，但運動的抑制與基因表達無顯著相關性。暴露至F3代仔魚，其生長發育和神經行為均不再受影響，僅gap43和gfap這2個基因表達量下調。表明隨著暴露代數的增加，TDCIPP的神經發育毒性效應降低。筆者首次研究了生物體多代處于環境劑量TDCIPP暴露后的毒性效應，為TDCIPP的生態風險評價提供了理論依據。在進一步的研究中，將結合化學分析和分子生物學手段，開展深層次的研究，力圖從化合物在生物體內的蓄積、代謝以及生物體的解毒代謝等多方面來揭示TDCIPP多代持續暴露后毒性減弱的機制。