通絡益腦方對急性局灶性腦缺血模型大鼠炎癥因子及腦細胞自噬相關蛋白的影響?

于法敖 林 艷 吳 棟 盛正乾 矯琰慶 梁 琳

（1.山東省青島市即墨區中醫醫院，山東 青島 266200；2.上海市第六人民醫院，上海 201400）

目前世界衛生組織認為腦血管疾病是危害人類生命和健康的三大高危疾病之一，缺血性腦血管病最為常見，約占腦血管疾病的70%～80%，其發病率高、致殘率高、死亡率高。缺血性腦缺血是因腦部血液循環障礙導致的局限性腦組織缺血壞死，停止供血、供氧，局部腦組織崩解破壞，腦組織受損[1]。急性局灶性腦缺血患者在發生和發展中多伴有炎癥反應。自噬參與細胞死亡的同時也保護惡劣環境中神經元維持自我內環境穩定性，在腦缺血神經元死亡中具有重要的作用。中醫學認為急性局灶性腦缺血痰瘀互結、腦脈不通所致，兼夾氣血、脾胃升降失調，治宜活血醒腦開竅[2-3]。通絡益腦方具有活血通絡、補腎益智之功效，為本院治療缺血性腦卒中患者的院內協定處方，具有較好的臨床療效[4]，但其作用機制尚不明確。因此本研究旨在觀察通絡益腦方對急性局灶性腦缺血模型大鼠腦組織病理學、炎癥因子及腦細胞自噬相關蛋白的影響，并探討其作用機制，旨在為臨床提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購于上海邦耀生物科技有限公司。置于（23±2）℃室溫中，晝夜節律，自由飲水進食，適應環境7 d后于9∶00～17∶00進行實驗。

1.2 藥物與試劑

1）藥品。通絡益腦方：黃芪 25 g，丹參 21 g，紅花、桃仁、川芎各18 g，何首烏15 g，遠志、肉蓯蓉、石菖蒲各12 g，水蛭、地龍各9 g，茯苓6 g。加8倍量（以重量計）水，浸泡1 h，煮沸30 min，雙層紗布過濾，留濾液，藥渣再加6倍量水，煮沸20 min，用上法過濾，合并兩次濾液，65℃恒溫水浴濃縮成0.25 g/mL，1 g/mL的煎煮液，放涼后待用，滅菌保存于4℃冰箱備用。2）試劑。水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），蘇木素和伊紅以及TTC（Sigma公司）、BCA蛋白定量試劑盒和Trizol試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、Beclin-1和Bcl-2抗體（Sigma公司）、PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）、尼莫地平片（拜耳醫藥保健公司，生產批號：L01984）；BDNF的ELISA試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；PBS緩沖液和二抗由碧云天生物技術研究所提供；其他試劑均為分析純，購于天津市廣成化學試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號：07112133）由山東康寧藥業有限公司提供，實驗用水為超純水。

1.3 實驗儀器

TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機（湖南湘儀離心機有限公司），BX61型顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統（麥克奧迪實業集團有限公司），RM2125型切片機和TPIIZO型全自動封閉式組織脫水機（德國徠卡公司），pH計（北京屹源電子科技有限公司），超低溫冰箱[冠森生物科技（上海）有限公司]，Y6-6LF型生物組織包埋機（上海世儀生物技術有限公司），電子天平（上海良平儀器有限公司），控溫水浴箱GKC（上海蘇達實驗儀器有限公司）。

1.4 分組與造模

1）分組：SPF級雄性SD大鼠，每籠5只，自由飲水進食，在室溫（23±2）℃下，通風良好的環境下自由飲食適應性喂養7 d后，進行敞箱實驗。將評分相近的60只SD大鼠隨機分為5組，每組10只，包括：假手術組、模型組、高劑量組、低劑量組和尼莫地平組。2）模型制備：參考文獻[5]制備急性局灶性腦缺血大鼠模型，將模型組及用藥組（尼莫地平組與高、低劑量組）大鼠，水合氯麻醉，俯臥固定于手術臺，采用改良線栓法制作腦缺血大鼠模型，分組分籠飼養，不禁食水。假手術組大鼠僅用玻璃分針游離出雙側頸總動脈不做結扎處理。

1.5 干預方法

造模成功后，假手術組自由飲水進食；模型組開始灌服純凈水；高劑量組灌服通絡益腦方200 mg/kg；低劑量組灌服通絡益腦方50 mg/kg；尼莫地平組開始以10 mg/kg灌服尼莫地平。模型組和用藥組每日灌胃1次，連續3周。

1.6 觀察指標

1.6.1 神經功能評分 采用Bederson評分分級法，于術后第3周對各組大鼠進行神經行為學評分并記錄結果。采用改良NSS評分標準對各組大鼠神經功能進行評分（16分制）。得數越高，損傷程度越重。

1.6.2 腦組織取材及處理 造模成功3周后，斷頭處死大鼠后迅速剝取腦組織，置于-20℃冰箱中15 min。取出腦組織，去掉嗅球、小腦、低位腦干，0.9%氯化鈉注射液清洗，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片。取切片置于2%TTC染色液中染色，避光孵育30 min，10%甲醛固定，通過經圖像分析系統測量腦梗死面積。其中梗死的腦組織呈白色，正常的腦組織為紅色。取切片脫蠟脫水，置于TUNEL試劑盒反應液和復合液中進行DAB顯色，蘇木素染色5 min后封片，陰性對照置于蒸餾水中，顯微鏡下觀察神經細胞凋亡情況，選取5個400倍視野分別計數凋亡細胞數目。

1.6.3 炎癥因子的測定 3周后收集3 mL外周血液，離心，分離血清，ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-2（IL-2）及白細胞介素-6（IL-6）炎癥因子水平以及ICAM-1水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6.4 自噬相關蛋白的測定 3周后斷頭取腦，稱取200 mg腦組織進行樣品制備，Trizol法提總RNA，嚴格按照逆轉錄試劑盒和相關引物的說明書加入相應量的試劑進行聚合酶鏈反應，BCA法測定蛋白濃度，RTPCR 檢測PI3K、Akt、Beclin-1以及Bcl-2蛋白相對表達水平。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較

見表1。模型組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分明顯高于其余各組（P＜0.05）。給藥后，尼莫地平組和高、低劑量組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分明顯低于模型組（P＜0.05），低劑量組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分與高劑量組以及尼莫地平組比較均有顯著性差異（P＜0.05），高劑量組與尼莫地平組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經功能評分和神經行為學評分比較（分，±s）

與假手術組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術組模型組尼莫地平組低劑量組高劑量組神經行為學評分0.00±0.00 5.68±1.21△3.08±0.49△▲4.24±0.74△▲3.25±0.52△▲n 10 10 10 10 10神經功能評分0.00±0.00 5.97±1.34△3.14±0.81△▲4.49±0.90△▲3.62±0.76△▲

2.2 各組大鼠腦梗死體積、神經細胞凋亡及ICAM-1比較

見表2。假手術組大鼠的腦組織未見明顯病理變化，神經元及神經膠質細胞結構正常，核仁明顯可見，模型組腦組織神經元結構模糊構型紊亂，出現不規則不同程度神經細胞變性壞死及炎細胞浸潤、核體核深染核的固縮，尼莫地平組和高、低劑量組與模型組相比均有不同程度的緩解恢復，腦組織神經元核固縮核體不規則程度有顯著的減輕、軟化灶明顯減少。見圖1。與假手術組比較，模型組大鼠的腦梗死體積、神經細胞凋亡以及ICAM-1明顯高于其余各組（P＜0.05），給予藥物治療后，尼莫地平組和高、低劑量組的腦梗死體積、神經細胞凋亡以及ICAM-1水平明顯降低（P＜0.05），低劑量組腦梗死體積、神經細胞凋亡以及ICAM-1水平明顯高于尼莫地平組和高劑量組（P＜0.05），尼莫地平組和高劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦梗死體積、神經細胞凋亡及ICAM-1比較（±s）

表2 各組大鼠腦梗死體積、神經細胞凋亡及ICAM-1比較（±s）

組別假手術組模型組尼莫地平組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10腦梗死體積（%）0.00±0.00 45.37±4.38△32.03±5.01△▲39.24±4.14△▲33.95±3.96△▲神經細胞凋亡（個）11.12±1.87 65.28±7.26△30.98±3.42△▲42.85±3.67△▲32.15±4.05△▲ICAM-1（ng/mL）22.06±3.47 29.24±4.36△23.37±3.59△▲25.64±4.12△▲23.68±3.87△▲

圖1 急性局灶性腦缺血模型大鼠腦組織病理圖片（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠炎癥因子比較

見表3。與假手術組比較，模型組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-2以及 IL-6水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預后，尼莫地平組和高、低劑量組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），低劑量組大鼠的炎癥因子明顯高于尼莫地平組和高劑量組（P＜0.05），而尼莫地平組和高劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠PI3K、Akt、Beclin-1及Bcl-2比較

見表4。與假手術組比較，模型組大鼠的PI3K、Akt、Beclin-1以及Bcl-2水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預后，尼莫地平組和高、低劑量組大鼠的自噬相關蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；低劑量組大鼠的自噬相關蛋白水平明顯與尼莫地平組和高劑量組有顯著性差異（P＜0.05），而陽性組和高劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠炎癥因子比較（μg/mL，±s）

表3 各組大鼠炎癥因子比較（μg/mL，±s）

組別假手術組模型組尼莫地平組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 TNF-α 39.73±6.09 55.57±7.24△41.39±7.05△▲42.37±5.94△▲46.15±7.23△▲IL-1β 4.53±0.67 6.72±0.85△4.66±0.54△▲4.85±0.46△▲4.69±0.71△▲IL-2 3.14±4.59 6.23±3.12△4.12±3.74△▲5.43±3.62△▲4.47±5.26△▲IL-6 21.12±2.67 30.47±3.86△23.57±3.45△▲25..15±2.56△▲23.87±3.09△▲

表4 各組大鼠PI3K、Akt、Beclin-1及Bcl-2比較（±s）

表4 各組大鼠PI3K、Akt、Beclin-1及Bcl-2比較（±s）

組別假手術組模型組尼莫地平組低劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 PI3K（mg/mL）1.07±0.57 3.63±0.84△1.53±0.78△▲1.62±0.62△▲1.56±0.81△▲Akt 0.54±0.13 3.31±1.53△1.24±0.34△▲1.58±0.45△▲1.32±0.51△▲Beclin-1（μg/mL）0.81±0.27 1.68±0.46△0.85±0.32△▲0.98±0.47△▲0.89±0.31△▲Bcl-2（pg/mL）0.76±0.17 1.54±0.36△0.87±0.29△▲1.04±0.32△▲0.91±0.28△▲

3 討 論

急性腦缺血是神經內科常見重癥疾病，其臨床病情進展快。神經功能行為學指標可真實反映腦缺血疾病程度，對腦缺血疾病的研究具有重要作用。炎癥因子是一種由淋巴細胞、血管內皮細胞、單核細胞以及巨噬細胞所釋放的免疫分子[6-7]。研究發現，腦缺血后存在炎癥反應，而炎癥反應釋放大量的氧自由基、一氧化氮、興奮性氨基酸等毒性物質，相互作用明顯造成腦組織不可逆的損傷，可誘發神經細胞凋亡，最終導致腦細胞凋亡甚至壞死，加重腦損傷[8]。TNF-α是炎癥反應的起始因子，具有多效促炎性及神經毒性作用，導致內皮細胞功能失調，致使內皮細胞屏障的滲透性增加[9]。IL-1β通過激活內皮細胞促使血栓形成，或增加誘導細胞間黏附分子表達，使大量中性粒細胞浸潤到腦組織，誘發炎性反應，是腦缺血損傷的病理生理基礎。IL-2是缺血性腦卒中發生發展過程的關鍵因素之一。IL-6為炎癥遞質，可加重腦缺再灌注的全身反應和局部損傷。ICAM-l參與炎癥反應和體液、細胞免疫應答，是判斷急性腦缺血損傷程度最強的免疫指標[10]。

自噬是哺乳動物通過溶酶體系統對細胞質大分子和細胞器進行降解的一個分解代謝過程[11]。PI3K/Akt信號通路是自噬網絡系統抗凋亡促存活的信號轉導通路，通過抑制細胞凋亡、加速細胞周期進而抑制細胞自噬。PI3K是Akt活化的首要調解者。Akt是PI3K/Akt核心部位，是PI3K的直接靶基因，是信號轉導通路中重要的蛋白激酶和抗凋亡調節因子[12]。Beclin1基因是自噬體的必需分子，代表自噬的活性，調節自噬體膜合成和物質轉運，是參與自噬的特異性基因。Bcl-2為高度同源蛋白中的經典的抗凋亡蛋白，不僅調節細胞凋亡而且在調控細胞自噬的過程中也有重要作用[13]。此外，Bcl-2還能調控氧化應激誘導自噬和凋亡[14]。Beclin1與Bcl-2家族蛋白持續結合在細胞穩定的內環境下抑制自噬的發生，而在細胞發生饑餓或使用自噬誘導劑情況下Beclin1與Bcl-2的解聚。因此，調控自噬與凋亡負反饋作用的關鍵因素是Beclin1與Bcl-2的平衡狀態。而且Bcl-2蛋白可阻止Beclin1蛋白與PI3KC3特異性結合，或者減少PI3KC3磷酸化活性而起到抑制自噬的作用。

急性腦缺血屬于中醫學“中風”范疇，痰瘀互結、腦脈不通為其病機，氣血、脾胃升降失調，治宜活血醒腦開竅。通絡益腦方方中黃芪補氣以推動血液運行。丹參、紅花、桃仁和川芎活血化瘀。何首烏和肉蓯蓉補益肝腎。遠志和石菖蒲益智，提高記憶力。水蛭和地龍活血化瘀通絡。茯苓補脾利水。諸藥合用以達到活血通絡、補腎益智之功效?，F代藥理證實[15-20]，方中的黃芪、丹參、紅花、水蛭、地龍以及茯苓的主要有效成分不僅能顯著抑制多種變態反應性炎癥，對腦缺血大鼠具有腦保護作用，可減輕神經細胞損傷。

本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠的神經功能評分、神經行為學評分、腦梗死體積、神經細胞凋亡、ICAM-1水平、TNF-α、IL-1β、IL-2以及IL-6水平、PI3K、Akt、Beclin-1以及Bcl-2水平明顯高于其余3組。給藥后，尼莫地平組和高、低劑量組大鼠的神經功能評分和神經行為學評分、腦梗死體積、神經細胞凋亡、ICAM-1水平、炎癥因子水平以及自噬相關蛋白水平明顯低于模型組，低劑量組與高劑量組及尼莫地平組比較均有顯著性差異，高劑量組與尼莫地平組比較無顯著性差異。結果提示通絡益腦方能有效地降低神經功能評分和神經行為學評分，減少腦梗死體積和神經細胞凋亡，降低炎癥因子和自噬相關蛋白水平。

綜上所述，通絡益腦方對急性局灶性腦缺血大鼠腦組織有較好的保護作用，可減少其腦梗死面積，保護腦組織免受炎癥因子的損傷，增加自噬相關蛋白水平，減少神經細胞的凋亡，激活腦細胞自我保護。