昆明地區慢性乙型肝炎患者替諾福韋酯耐藥突變位點情況調查

普 冬，李曉非，余婷婷，王紅英，張潤武，李麗華，白 經，丁彩梅，李冬玲，楊永銳

（昆明市第三人民醫院檢驗科，云南昆明 650041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） 感染是導致慢性肝炎、肝癌和肝硬化的重要因素。一直在我國人群中具有較高的感染率，據云南省CDC2016年底的最新調查，我省年均發病率為51.99/10 萬，昆明市為高發區，累計報告病例居第一。核苷酸類似物作為HBV 感染的常規治療藥物之一，面臨一個嚴峻的問題，即核苷類似物的耐藥性[1]，耐藥的發生極大地降低了慢性乙型肝炎患者的治療效果。替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF） 是美國肝病學會（AASLD） 和歐洲肝病學會（EASL） 推薦的一線強效抗病毒藥物[2]近年來，我院部分患者已經開始使用該藥進行治療，因此對替諾福韋酯耐藥相關的位點的突變情況，進行監測對慢性乙型肝炎的治療與預后具有重要的意義。基因測序是公認的突變檢測的金標準，因為測序檢測的是乙肝耐藥易突變區域的完整序列，是判斷病毒核酸堿基突變與否的最直接和最可靠的方法[3]。本研究通過Sanger 測序（雙脫氧末端終止法），對昆明地區2 707例HBV DNA 陽性的慢性乙肝患者，HBV P 基因區進行了測序和分析，探討TDF 在本地區慢性乙型肝炎患者中，不同HBV 基因型和替諾福韋酯耐藥相關的位點的突變情況，及其HBV-DNA 量和HBeAg 之間的關系。以期為臨床工作者在慢性乙型肝炎使用替諾福韋酯治療方面提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取昆明市第三人民醫院2017年5月至2019年3月期間，住院及門診就診的2 707例慢性乙型肝炎患者血清標本，男1905例，女802例，年齡14～78 歲，平均46 歲。診斷均符合2015 版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 HBV-DNA病毒DNA／RNA 提取試劑盒（磁珠吸附法） 提取試劑盒，購自蘇州天隆生物科技有限公司；HBV-DNA 純化試劑盒購自西安天隆生物科技有限公司；乙型肝炎病毒分型和耐藥測序試劑盒購自廣州立菲達安診斷產品技術有限公司；血清HBsAg 測定試劑購自羅氏診斷公司；血清ALT 定量測定試劑購自該公司；CFX96 自動實時熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司；3500Dx測序儀購自美國ABI 公司；AU5400 型生化分析儀購自日本奧林巴斯公司；M odular E170 全自動電化學發光免疫分析儀購自瑞士羅氏診斷公司。

1.2.2 標本采集采集慢性乙型肝炎患者空腹不抗凝靜脈血3 mL，離心10 min，3 000 r/min，分離血清置1.5 mL離心管中，-20℃儲存備用。

1.2.3 HBV DNA 定量檢測采用實時熒光定量PCR 方法對乙肝病毒載量進行檢測，檢測靈敏度為1×102IU/mL，具體操作嚴格按說明書進行。

1.2.4 乙肝病毒分型和耐藥基因位點檢測從血清標本中提取乙肝病毒DNA，通過PCR 擴增HBV P 區RT 段序列，擴增產物純化后，在ABI 3500DX測序儀上直接進行Sanger 測序（雙脫氧末端終止法）。測序具體操作嚴格按說明書進行。通過序列比對分析乙肝病毒基因型和HBV P 區核苷類藥物耐藥相關位點的突變情況，具體包括：rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250 等。

1.2.5 耐藥位點與不同藥物的關系：（1）rtM204I/V/S 和rtL180M：為拉米夫定、替比夫定與恩曲他濱的主要耐藥位點；（2） rtA181T/V/S 和rtN236T/V：檢出這兩個耐藥位點中的任一個位點陽性即可判斷阿德福韋酯耐藥，檢出其它位點視為不確定的、證據不充分、尚需進一步證實的耐藥位點；替諾福韋酯是比較新的上市藥物，目前還沒有針對TDF/TAF 相關長期用藥的耐藥研究報道，但rtN236T/V、A194T 和rt A181T/V 位點突變會引起替諾福韋酯酯不敏感，是主要的替諾福韋酯耐藥相關位點；（3） rtM204 和rtL180M 與（（rtV173L、rt I169T、rtM250V、rtT184/G、rtS202I/G） 5 種突變中的任意一種或兩種組合，就可判斷恩替卡韋耐藥，rtM204V 和L180M 單獨突變則引起恩替卡韋不敏感。

1.2.6 耐藥敏感性判讀針對不同藥物的耐藥位點分類及檢出情況，參照《2017年歐洲肝病年會乙型肝炎病毒感染臨床實踐指南要點》[5]判讀，見表1。

表1 常見的HBV 基因型耐藥與藥物敏感性Tab.1 Common HBV genotype resistance and drug sensitivity

1.2.7 血清HBsAg 測定采用瑞士羅氏診斷公司M odular E610 全自動電化學發光免疫分析儀對血清HBsA g 進行測定，樣品檢測結果為：S/CO≥1.0為陽性。

1.2.8 血清ALT 定量測定采用日本奧林巴斯AU5400 型生化分析儀檢測血清ALT，正常范圍上限為40 U/L。

1.3 統計學處理

采用統計軟件SPSS 對檢測數據進行分析。比較核苷酸類藥物耐藥標本的計數，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 替諾福韋酯耐藥相關位點變異慢性乙肝患者基因型發布情況

本研究2707例慢性乙肝患者中，共有52例（1.92%，52/2707） 患者檢測到替諾福韋酯耐藥相關位點的突變，變異率為1.92%。52例患者中HBV 基因型以C 型為主占65.38%（34/52），B 型次之占34.62% （18/52），D 型沒有發現。B 基因型和C 基因型HBV 感染率分別為34.62%（18/52）和65.38%（34/52），基因型分布與昆明地區的總體分布一致，昆明地區HBV 基因型以C 型為主占62.43% （1690/2707），B 型 次 之 占 37.31%（1010/2707），D 型也有發現占0.26% （7/2707），但與國內相關研究報告[6]比較，本地區的HBV 基因型分布狀況有獨立特征。52例替諾福韋酯耐藥相關位點變異的慢性乙肝患者，其基因型和基本資料見表2。

2.2 52例檢測到替諾福韋酯耐藥相關位點突變的檢出結果

檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關位點突變（A194T、N236T、A181T/V），耐藥不敏感性I（1.92%，52/2707）。其中A181T/V 位點單獨突變率最高（19.23%），N236T 位點單獨突變率次之（15.38%），A194T 位點單獨突變率最低（9.61%）；檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥突變相關的位點（A194T、N236T、A181T/V） 和次要/ 補償耐藥位點（I169T、M204V/I、L180M 等） 的二個位點混合突變26例，主要是：A181T/V+N236T，10例（19.23%）；A181T/V+M204V/I，8例（15.38%），同時也檢出2例三個位點混合突變，分別為：A181T/V+N236T+V173，1例（1.92%）；A181T/V+M204V/I+L180M，1例（1.92%），見表3。

表2 52例替諾福韋酯耐藥相關位點變異慢性乙肝患者基因型和基本資料Tab.2 Genotype and basic data of 52 chronic hepatitis B patients with tenofovir resistance mutation

表3 52例慢性乙肝患者替諾福韋酯耐藥相關位點突變的檢出結果Tab.3 The result of tenofovir resistant mutation sites in the 52 chronic hepatitis B patients

2.3 替諾福韋酯耐藥相關位點變異與HBV-DNA量的相關性分析

對24例檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關位點（A194T、N236T、A181T/V） 單獨突變的慢性乙肝患者，按照HBV-DNA 水平分為：低于檢測線（＜102IU/mL），低水平（102～104IU/mL）；中水平（105～107IU/mL）；高水平（≥107，IU/mL）4 個組，各組分別有2例（3.84%）。16例（30.75%），4例（7.69%），2例（3.84%）。替諾福韋酯耐藥相關位點單獨變異在各組間的檢出率差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。其中HBV-DNA 中，低水平兩組的各耐藥位點的突變檢出率較高。而對HBV-DNA 中，低水平為102～104IU/mL 和105～107IU/mL 兩組進行HBV 耐藥突變差異分析，發現各耐藥位點在這兩組間的突變檢出率差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 替諾福韋酯耐藥相關位點變異檢出率與HBV-DNA 量的關系［n（%）］Tab.4 The relationship between tenofovir resistance mutation rate and HBV-DNA level ［n（%）］

2.4 不同HBeAg 狀態下替諾福韋酯耐藥相關位點的變異率

替諾福韋酯耐藥相關位點變異與HBeAg 的關系24例檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關位點（A194T、N236T、A181T/V） 單獨突變的慢性乙肝患者中，e 抗原陽性者9例（37.50%），e 抗原陰性者15例（62.50%）。替諾福韋酯耐藥相關位點A181T/V 變異在HBeAg 陽性組的突變檢出率較高，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 替諾福韋酯耐藥相關位點變異率與不同HBeAg 狀態的關系［n（%）］Tab.5 The relationship between tenofovir resistance mutation rate and HBeAg level ［n（%）］

2.5 不同ALT 狀態下替諾福韋酯耐藥相關位點的變異率

替諾福韋酯耐藥相關位點變異與ALT 的關系24例檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關位點（A194T、N236T、A181T/V） 單獨突變的慢性乙肝患者中，ALT 值超過正常范圍上限（40 U/L） 者10例 （41.67%），ALT 值屬于正常范圍者14例（58.33%）。替諾福韋酯耐藥相關位點A181T/V 變異在ALT 值異常組的突變檢出率較高，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表6 替諾福韋酯耐藥相關位點變異率與不同ALT 狀態的關系［n（%）］Tab.6 The relationship between tenofovir resistance mutation rate and ALT level ［n（%）］

3 討論

目前替諾福韋酯治療慢性乙肝患者的療效已得到肯定，被國內外權威肝病治療指南推薦為慢性乙型肝炎抗病毒治療的一線藥物，因替諾福韋酯作為治療慢乙肝的新藥，其作用機制及優勢較為顯著[7]，又屬于強效低耐藥基因屏障藥物，目前尚無明確的耐藥性報道。雖然口服核苷類治療有明確的抑制HBV 的作用，但由于HBV 復制過程中有反轉錄過程，而反轉錄酶不具DNA 聚合酶的3’～5’校正功能，患者長期使用單種核苷酸類藥物，再加上HBV 復制很快，極容易引起HBV 針對此藥物的耐藥突變[8]。而替諾福韋酯作為一種核苷酸類藥物，對其耐藥相關位點變異的發生，在不同HBV 基因型和HBV—DNAh 載量，以及不同HBeAg 和ALT 狀態下的情況進行調查分析。

有研究表明[6]，HBV 基因型分布存在一定的地域性差異，我國南方以B 型為主，北方以C 型為主，D 型主要見于西藏和部分少數民族地區。本研究提示檢測到替諾福韋酯耐藥相關位點的突變52例患者中，B 基因型和C 基因型HBV 感染率分別為34.62% （18/52） 和65.38% （34/52），基因型分布與昆明地區的總體分布一致，昆明地區HBV基因型以C 型為主占62.43% （1690/2707），B 型次之占37.31% （1010/2707），D 型也有發現占0.26%（7/2707） 與以上研究結論相比較，本地區的HBV 基因型分布狀況有獨立特征。可能是昆明地區人口流動的增加，傳播途徑特點等因素改變，造成基因型呈多樣化的趨勢，流行分布正在發生變化。本研究中D 型也有發現占0.26%（7/2707），與國內相關研究[9]，在新疆、云南和福建發現了D型分布的發現一致。目前有研究[10]表明替諾福韋酯對HBV 基因型B，C 型慢性乙型肝炎的治療效果差異無統計學意義。但也有李火炎等人[11]的研究指出，針對不同基因型HBeAg 陽性慢性乙型肝炎患者，治療效果也存在一定的差別，本研究提示檢測到替諾福韋酯耐藥相關位點的突變52例患者中，HBV 基因型以C 型為主占65.38%（34/52），這就提示臨床在使用替諾福韋酯治療時，需要對其治療效果是否存在差異進一步的研究。

本研究中2707例患者中，共有52例（1.92%，52/2707） 患者檢出與替諾福韋酯（TDF）耐藥相關位點突變（A194T、N236T、A181T/V），耐藥不敏感性I（1.92%，52/2707），其中A181T/V位點單獨突變率最高（19.23%），有研究表明，A181T/V 變異病毒對大部分抗HBV 核苷（酸） 類藥物均呈現一定程度的耐藥性，對恩替卡韋的敏感性降低12～15 倍[12]，A181T 突變的病毒株對恩替卡韋仍舊敏感[13]。另有體外實驗還發現，A181T/V 或N236T ADV 耐藥株對TDF 的敏感性下降3～4 倍[14]。雖然替諾福韋酯尚未發現耐藥株，但這類突變發生的比例相對較高，提示了產生替諾福韋酯耐藥不敏感性（1.92%） 的問題，是應該引起臨床進一步追蹤研究的。另外，檢出A194T位點單獨突變率最低（9.61%），有研究表明，194位丙氨酸至蘇氨酸的替換（rtAl94T） 與TDF 耐藥相關[15]，出現該耐藥后對ETV 仍敏感[16]，與替諾福韋酯（TDF） 耐藥突變相關的位點（A194T、N236T、A181T/V） 和次要/補償耐藥位點（I169T、M204V/I、L180M 等） 的二個位點混合突變26例，主要是：A181T/V+N236T，聯合變異10例，A181T/V+M204V/I，8例，同時也檢出2例三個位點混合突變，原因有待進一步研究。雖然有研究發現，TDF 治療LAM 或LdT 耐藥的患者較ADV 更有效，挽救療法時TDF 單藥即足夠[17]。然而本研究結果顯示，相關替諾福韋酯（TDF） 耐藥位點（A194T、N236T、A181T/V） 的突變，會導致ETV和TDF 的耐藥不敏感性，這與ISuzuki 等[18]新近研究結果一致，其報道一組耐藥CHB 患者聯合使用ETV+TDF 治療后出現病毒學了突破，因此臨床對耐藥患者進行TDF 挽救治療時，需要進行密切隨訪和評估。

替諾福韋酯酯耐藥相關位點單獨變異HBV-DNA 載量的中，低水平兩組的各耐藥位點的突變檢出率較高。與榮海燕等[19]的研究結果相似，當HBV-DNA 量達到中等水平時，突變株和野生株形成一種平衡狀態，突變株檢出率不再發生變化。本研究結果發現，A181T/V 單獨突變的檢出率較高，并且主要在HBV-DNA 載量的中，低水平兩組病例中，可能與文獻[20]研究結果一致，該突變會引起病毒在肝細胞內的積聚和HBV DNA 載量的下降，這將影響臨床上僅僅依據血清HBV DNA 水平診斷病毒學突破的結果，提示臨床需加強關注。而對HBV-DNA 載量的中，低水平為102～104IU/mL 和105～107IU/mL 兩組進行HBV 耐藥突變差異分析，發現各耐藥位點在這兩組間的突變檢出率無統計學差異（P＞0.05），但是HBV-DNA 載量呈反復低水平波動的患者，其病理損傷和預后都是不可預料的，現有報道也很少，未來需要更關注此類人群。

檢出與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關位點（A194T、N236T、A181T/V） 單獨突變的24例慢性乙肝患者中，e 抗原陽性者9例 （37.50%），A181T/V 變異在HBeAg 陽性組的突變檢出率較高6例（66.67%），其差異有統計學意義（P＜0.05），e抗原陽性組的總突變檢出率及（TDF） 耐藥相關位點突變檢出率與e 抗原陰性組無顯著差異，表明這兩者不具有相關性。HBeAg 可以反映HBV 復制具有傳染性，替諾福韋酯作為一種核苷酸類藥物，其可以有效的抑制乙型肝炎病毒多聚酶，但是與替諾福韋酯（TDF） 耐藥相關位點突變的檢出，提示存在替諾福韋酯的耐藥不敏感性，治療效果可能也會存在一定的差別，李忠斌等[21]經研究發現，經其它核苷類藥物耐藥的慢性乙型肝炎患者換用替諾福韋酯治療后應答欠佳，同時檢測到耐藥突變的HBV 突變株在使用替諾福韋酯治療期間仍存在，提出其它核苷類藥物與替諾福韋酯可能存在交叉耐藥位點，因此筆者應該對其進行深入的研究。替諾福韋酯耐藥相關位點A181T/V 變異在ALT 值異常組的突變檢出率較高，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。在平時的檢測和診斷中應引起足夠重視。

替諾福韋酯屬于新型強效低耐藥基因屏障藥物，被國際權威肝病治療指南推薦用于慢性乙型肝炎抗病毒治療的一線藥物，臨床療效卓越，目前尚無耐藥性報，并且替諾福韋酯在本地區尚未廣泛應用，缺乏研究資料。本研究使用基因測序法對昆明地區慢性乙型肝炎患者，基因型和替諾福韋酯耐藥相關位點，進行了準確有效的檢測，并分對替諾福韋酯耐藥位點突變與HBV-DNA 載量和HBeAg 之間的關系進行分析研究，了解本地區慢性乙肝患者替諾福韋酯耐藥突變情況具有獨立特征，國內外學者對于應用替諾福韋酯治療療效，意見尚不統一，如VAN B0M M E L 等[22]研究得出結論：在其它核苷類藥物耐藥患者中，替諾福韋酯治療敏感性僅輕度降低，可作為進一步被選擇的藥物。可見，只有通過更深入研究，才能更加明確替諾福韋酯療效，從而更好地指導臨床制定個體化抗病毒治療方案，更加關注治療效果不好的或者是治療反應很差的患者，為精準醫療提供有力的客觀依據。