腸道菌群和免疫在結直腸腫瘤中作用研究進展

梁 睿，淳于緯訓，沈 燾，孫 樂，李云峰

（1） 昆明醫科大學第三附屬醫院結直腸外科，云南昆明 650118；2） 昆明醫科大學基礎醫學院病原生物學與免疫學系，云南昆明 650500）

結直腸腫瘤全球發病率在所有腫瘤中排第三位，死亡率排在第二位，在我國，結直腸腫瘤發病率、死亡率均位居第四位，并在10 a 有明顯升高趨勢，發現新的預防標志物和治療靶點已成為研究熱點。而腸道菌群超過100 萬億，主要定植在人體的結直腸中，在機體免疫系統的形成和疾病抵抗中起著不可或缺的作用。測序技術和宏基因組學的迅速發展，發現腸道菌群與機體免疫系統相互作用，在結直腸腫瘤的發生發展中起到重要的作用。

1 結直腸腫瘤發生發展和腸道菌群的關系

1.1 結直腸癌發生和腸道菌群的關系

2012年[1]有研究表明，具核梭桿菌（Fusobacterium，Fn） 相比與正常組織，在結直腸腫瘤中高度富集，其能誘導局部炎癥，增加炎性細 胞 因 子 如 IL-6，IL-8，IL-12，TGF-β，TNF-α 等，從而使結直腸腫瘤的發生。此后越來越多的研究表明，腸道菌群的變化可能是結直腸癌發生不可或缺的部分[1-5]。眾所周知，結直腸癌的發生主要沿著腺瘤-CRC 軸進行（由正常粘膜上皮到異型增生、腺瘤、CRC）。結合此發展進程及與菌群變化的關系有兩種著名的假說，一是Sears和Pardoll 提出“alpha-bug”假說（類似于Hajishengallis 提出的keystone pathogen 模型）[6-7]，如脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis，ETBF） 可作為主要致病菌，導致結腸菌群重構，引發炎癥反應和基因毒性反應，從而導致上皮增生、異性增生，最后導致CRC 的發生。二是Tjalsma 等提出的driver-passenger 模型，驅動致病菌（bacteria driver） 在腸道中繁殖，產生驅動的基因毒素，引起腸道微環境改變和誘發促炎癥反應，進而使腸道菌群改變，導致腫瘤發生的菌群豐度增加，在整個腸道菌群中超過驅動致病菌（bacteria driver） 并取代其主導位置導致結直腸腫瘤的進一步發生，如ETBF 最初可能在腸粘膜上定植，通過產生B.fragiliusin 毒素（BFT），colibactin 和細胞死亡毒素（CDT），從而導致腸內環境改變，使梭桿菌和鏈球菌等在整個腸道微生物群中逐漸超過ETBF，成為新的優勢菌群，從而進一步沿著腺瘤-CRC 進行[8]。隨著研究的深入，ETBF 和Fn 等與結直腸癌發生相關的特異性菌株被確定。Fn 是口腔中常見的共生菌，是一種具有侵襲性和促炎性的厭氧菌。Mauro Castellarin 等使用RNA-seq 法篩選結直腸癌與正常組織標本后提出Fn 感染在人類結直腸癌中較為常見，揭示了Fn 在結直腸癌的發生中可能起重要作用[1]。Mara Roxana Rubinstein 等進一步研究確認了Fn 可通過FadA 粘附與E-cadherin 結合，激活β-catenin 和Wnt 通路，促進癌細胞增殖，誘導致癌和炎癥反應[9]，從而確認了Fn 在結直腸癌中發生中的作用機制。

另一方面，家族性息肉病和結腸炎被認為是結直腸癌的癌前疾病。Dejea Christine M 等[10]證實在家族性息肉病患者中（FAP），當產生BFT 的ETBF 和pks+的大腸桿菌同時存在時才能促進CRC 的發生，ETBF 降解粘液層增加pks+的大腸桿菌的粘附，誘導colibactin 產生，導致結腸上皮細胞DNA 損傷，表明菌群致癌作用在結直腸癌前疾病中同樣占有重要地位。已有研究表明患有炎癥性腸病（IBD） 的患者，包括克羅恩病（CD） 和潰瘍性結腸炎（UC），患CAC（結腸炎相關性CRC） 的風險指數很高，預后較差[11-12]。介于結腸炎和結腸癌之間密切的關系，通過比較炎癌轉化之間的細菌變化來找到相關致病菌和開發針對其的特效抗生素成為熱點。在急性和慢性的結腸炎性疾病的致病過程中，微生物的主要角色地位已被確定[13-14]。隨著化學致癌的小鼠結直腸炎癥和腫瘤模型的成功構建為后續的研究墊定了基礎。單劑量的氧化偶氮甲烷（AOM） 和三個循環的DSS可以在小鼠體內誘導從結腸炎到結腸腫瘤的模型（CAC），對CAC 小鼠模型的縱向研究揭示了在化學誘導的慢性腸道炎癥存在下腸道菌群結構的變化[15-16]。使得在結直腸炎癥時期控制菌群變化降低結腸腫瘤的發生成為可能。腸道菌群在炎癌之間的作用已日益明顯，隨著糞菌移植（FMT） 的飛速發展，或許能夠在腸道炎癌的治療上起到不可或缺的作用。目前臨床上以將FMT 治療復發性艱難梭桿菌列入治療指南[17]。許多研究已表明FMT 在克羅恩病，腸易激綜合征等疾病中治療的有效性[18-21]。移植健康供體在厭氧條件下制備的混合糞菌，可有效持久的緩解輕中度UC[22]。雖然FMT 在治療腸道炎癥具有一定優勢，但其在疾病中的效果和臨床試驗仍需進一步規范和發展，此外其在結直腸腫瘤中的效果也待研究。

1.2 結直腸癌發展和腸道菌群的關系

近年來隨著HMP 計劃（人體微生物組計劃）和EMP 計劃的（地球微生物基因組研究項目） 不斷展開，結直腸癌發展中菌群的作用研究也受到越來越多研究者的關注。Chung Yu Ta 等[23]研究發現化療后復發患者的結直腸癌組織中的Fn 豐度異常增高，并且與患者的臨床病理學特征有關，并揭示Fn 靶向TLR4 和MYD88 先天免疫信號傳導和特異性微小RNA 以激活自噬途徑，導致CRC 的化療耐受。Deng Xingming 等[24]利用16S rRNA 基因測序檢測手術或化療后結直腸癌患者菌群的變化，發現手術治療后腸道菌群的多樣性顯著降低，同時擬桿菌及厚壁菌的豐度降低，以及變形菌的豐度增加；在化療病人中，一些特定菌株如薩特氏菌、殊異韋榮菌與化療有關，提示這些細菌可能與化療抗性存在著潛在的關聯。有研究表明，結直腸癌組織中的Fn 等菌群會隨著癌細胞一同轉移，Fn 可能與其他種屬細菌共同作用，促進CRC的肝轉移[25]。目前針對結直腸癌臨床TNM 分期或病理分級與腸道菌群的研究尚少，了解其進展中菌群的變化可進一步深入了解及完善腸道菌群和CRC 發生發展之間的關系。

這些研究表明腸道菌群結構的變化在CRC 的發生發展中起重要作用，這預示著腸道菌群中的特定菌群變化可以作為結直腸的預防性生物標志物，從而用于早癌篩查是未來研究的方向。此外，針對如Fn 類促癌菌群的特異性抗菌劑也是未來治療結直腸腫瘤待解決的問題。

2 結直腸腫瘤、腸道菌群和免疫

在過去幾年中，隨著腸道菌群的研究在神經系統、內分泌系統、泌尿系統等疾病的深入研究，其逐漸被認為是人類第二套的基因，在各種疾病中起著不可或缺的作用[26-28]。人類流行病學研究和小鼠模型實驗表明，腸道微生物群決定了抗癌免疫治療的有效性。因此，微生物群提供了新的預后生物標志物，并顯示出作為未來抗腫瘤治療的前景。腸道微生物組，腸道生理學，全身代謝，免疫系統和腫瘤疾病之間出現了多維功能連接網絡。方法學進展標志著筆者能夠描述個體細菌物種對腸屏障和機體廣泛免疫反應的影響[29-30]。在下文中筆者從菌群和免疫，菌群、結直腸腫瘤和免疫分別討論。

2.1 腸道菌群和免疫

哺乳動物的胃腸道內有多種微生物群落，包括細菌、真菌和病毒。腸道微生物群形成先天免疫系統和適應性免疫，調節腸道和全身疾病的發病機制[31-32]。而在Paul Wilmes 的研究中發現通過順產的嬰兒會從母體縱向獲得擬桿菌門、放線菌門中的23 個分類群（包括擬桿菌屬和雙歧桿菌屬），并且這些菌群和LPS（腸道脂多糖） 的合成有關，LPS 可刺激免疫系統，引起TNF-α 和IL-18 的升高，而剖腹產嬰兒體內缺乏這一類菌群，從而影響免疫功能[33]，表明腸道菌群在免疫形成階段可能也起著不可或缺的功能。

雖然腸道上皮細胞不是傳統意義上的免疫細胞，但其配有豐富的免疫受體，這些受體的表達和活性信號轉導對腸道菌群的識別，是維持腸道穩態的關鍵。在上皮特異性缺失的情況下，腸道屏障被破壞，共生菌和腸道固有層分離，導致組織自發性炎癥的產生[34]。模式識別受體PRRs（如TOLL 樣受體TLRs 和NOD 樣受體NOD1 和NOD2）在其中起著關鍵性作用。TLRs 中腸上皮表達的TLR5，在2 周新生小鼠高表達，深入研究表明TLR5 能夠和細菌鞭毛蛋白結合，致使Reg3γ 分泌，限制表達鞭毛蛋白的細菌在腸道定植，確保正常菌群在腸道的建立[35]，表明免疫系統和菌群彼此作用，維持腸道穩態。在小腸潘氏細胞中高表達的NOD2 能夠被細菌的肽聚糖激活產生一系列細胞反應，包括細胞因子的分泌，誘導自噬，上皮再生，以及抗菌肽的產生，從而引起菌群結構的改變[36-38]。Khosravi 等[39]的研究表明在缺乏微生物群的情況下，無菌小鼠骨髓中髓樣細胞的發育減少，導致全身細菌感染的清除延遲。在腸道中，微生物產生的SCFAs（短鏈脂肪酸） 可作為改變局部巨噬細胞表達譜信號[40]。目前絕大多數研究集中在先天淋巴細胞（ILCs） 上，研究表明，其發育不受菌群影響，但其正常功能依賴于共生菌的定植，Yoshiyuki Goto 等[41]發現ILC3 在腸道共生菌群的適當刺激下能夠分泌IL-22，誘導上皮細胞的巖藻糖基化，抵御外來病原菌。

由上皮細胞分泌的免疫球蛋白IgA 在腸道菌群也有著重要作用，Jehane Fadlallah 等的通過分析IgA 缺乏患者和健康人的糞菌，患者腸道菌群輕度失調，部分促炎分類菌增加，抗炎分類菌減少，說明IgA 能夠參與塑造腸道菌群[42]。此外Atarashi K 等研究表明在腸道中的一些細菌如分節絲狀菌可粘附在腸道上皮細胞從而誘導Th17 細胞（促炎細胞） 的積累，同時還從潰瘍性結腸炎患者糞便中分離出20 種此類細菌[43]，表明腸道菌群有可能是Th17 增殖過程中重要的“刺激劑”。Th17 細胞與Tregs（調節性T 細胞，抑炎細胞） 共同存在于腸道固有層，兩者數量的平衡對腸道穩態的維持至關重要，Tregs 可以被細菌的產物短鏈脂肪酸誘導[44]，這都表明腸道菌群與先天免疫及適應性免疫都存在重要的相互作用。

2.2 結直腸腫瘤、腸道菌群和免疫

越來越多的研究表明，腸道微生物可以影響各種癌癥并對癌癥免疫治療的療效起著重要的作用。2018年發表的幾項研究表明在接受過PD-1抑制劑治療肺癌、腎癌等不同類型腫瘤患者中，未服用抗生素而菌群正常的患者總生存率明顯優于服用過抗生素導致菌群異常的患者，在黑色素瘤中同樣存在類似結果，表明菌群在免疫治療中可能起到重要作用[45-47]。此外菌群可能直接作用于免疫細胞改善腫瘤進展，最新研究表明從健康志愿者糞便中分離的11 株菌在聯合定植與小鼠腸道時，可通過依賴于CD103+樹突細胞和MHC Ia 抗原呈遞分子在小鼠腸道誘導生成IFN-γ+CD8T 細胞，增強抗腫瘤免疫，抑制小鼠的腫瘤進程，而這些菌株在人體腸道為低豐度，可能為腫瘤治療提供新的思路[48]。

在結直腸癌的免疫研究已逐漸深入。Chen Grace Y 等[49]在NOD1-/-小鼠中發現，共生腸道菌群能夠通過NOD1 刺激保護腸上皮屏障，以限制對腸上皮的損傷，此外能夠特異性激活NOD1 的共生細菌比具有低特異性的細菌更能預防結腸腫瘤的發生，這一研究表明機體免疫和某些共生菌群的相互協助在結直腸腫瘤的發生中可能起到不可或缺的作用。Tsoi Ho 等[50]研究發現厭氧鏈球菌在人結腸癌和腺瘤組織中高表達，這種細菌通過和腸上皮細胞的TLR2 和TLR4 相互作用，增加ROS（活性氧） 水平，促進膽固醇合成和細胞增殖，從而導致腫瘤的發生。Kostic A 等[51]進一步研究證明，使用ApcMin/+小鼠喂養8 周Fn 和不喂養組作為對照，檢測腫瘤中免疫細胞發現喂養Fn能夠選擇性的增加CD11b+髓樣細胞，包括MDSCs（骨髓抑制細胞）、TAMs（腫瘤相關巨噬細胞）、DCs（樹突狀細胞），這些細胞能夠抑制T 細胞的應答，從而促進腫瘤的發展。臨床研究證明了Fn 在結直腸腫瘤中所起的作用，鑒于Fn 在下調T 細胞介導的抗腫瘤免疫應答反應中的作用，未來針對Fn 的免疫療法也是一個開展方向。而Malik Ankit等[52]研究表明IL-33 能夠促進IgA 的產生，維持腸道菌群的穩態，從而限制結直腸腫瘤的發生。CTLs（腫瘤細胞毒性T 淋巴細胞）、TH1（輔助性T 細胞）、Tregs（胸腺來源的調節性T 細胞）、Tfh（濾泡輔助性T 細胞） 在結直腸腫瘤中的浸潤可延長患者生存期。Cremonesi Eleonora 等[53]通過相關實驗證明在腸道菌群的刺激下，結直腸腫瘤細胞分泌大量趨化因子，而這些因子能夠招募相關T 淋巴細胞（如CCL5、CXCL9、CXCL10 能夠招募CTLs 和Th1，CCL17、CCL22、CXCL12 招募Th1 和Tregs，CXCL13 招 募Tfh，CCL20 和CCL17 能夠招募Th17），從而延長患者預后，而CCL20，CXCL10 和CXCL11 的表達水平與細菌負荷明顯相關，此外檢測到Rikenellaceae，Ruminococcace 和 Lachnospiracee 豐 度 與 CCL5，CCL20 和CXCL11 表達水平之間有著明顯的相關性。

至此，筆者以得知腸道菌群具有促進抗腫瘤免疫反應和抑制抗腫瘤免疫反應的雙重作用，然而目前對于菌群中有利于腸道保護，抵抗結直腸癌腫瘤的發生的純培養菌株研究尚少，且機制研究不明確，如何利用菌群的促進抗腫瘤的免疫反應并改善腫瘤免疫微環境，抑制其害處是未來研究的熱點。此外如同在其他腫瘤中的作用，調整菌群能否改善免疫治療對結直腸腫瘤的作用也是新的方向。

3 展望

腸道菌群在腫瘤中的作用吸引了越來越多的研究者關注，對其中機制的研究也在逐漸深入，但仍有大量問題需要解決。人體腸道菌群超過100萬億，與人體細胞數量相同。而目前技術對于菌群的具體研究也只是滄海一粟，對于更多細菌的認識和培養，是未來研究中必不可少的部分。此外，研究表明梭狀芽孢桿菌分泌的丁酸鹽能夠促進Treg 分化，緩解小鼠的結腸炎[44]。表明腸道菌群的代謝物質很大一部分能夠對機體產生作用，菌群代謝與腫瘤的治療相聯系仍有很長的路要走。

近年來，腸道中真菌在結直腸癌中的作用也逐漸成為研究熱點。在Wang Tingting 等[54]的研究表明接頭蛋白CARD 的缺乏可以導致巨噬細胞殺滅真菌的能力受損，小鼠腸道真菌增多，特別是熱帶念球菌，且其能夠將小鼠骨髓細胞誘導為MDSC（骨髓抑制細胞） 從而對免疫細胞CD4+和CD8+T細胞有強力抑制作用從而導致結直腸腫瘤的進展。隨著單細胞測序的發展，將其利用到結直腸腫瘤的菌群免疫中，通過對其中的免疫細胞進行分群及其起作用的免疫細胞鑒定可能也是未來研究的方向。

總之，筆者可以明顯推斷出在結直腸腫瘤的發生發展中，菌群和免疫系統的相互作用一直存在，并起著至關重要的作用。通過早期腸道菌群的變化對結直腸腫瘤進行早期干預治療將成為未來研究的一個重要方向。而維持菌群和人體免疫應答的平衡，基于腸道菌群的治療方案將是IBD 和腸道腫瘤的新的突破點。