高鐵肌紅蛋白氧化對牦牛肉肌原纖維蛋白生化特性的影響

崔文斌，宋艷艷，李明華，張 麗,*，余群力，韓 玲，魏晉梅，郭兆斌

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

由于特殊的自然環境及自由的放牧方式，牦牛肉質鮮美、營養物質豐富，越來越引起國內外學術界和商業界人士的廣泛關注。但是，由于肉及其制品在加工貯藏等過程中會不可避免受到溫度、氧氣和催化劑等外界因素的干擾，從而導致肉品質量下降，品質劣變嚴重[1]。在宰后肉品的成熟過程當中，肌肉蛋白的氧化會導致側鏈氨基酸的氧化修飾，其中主要包括巰基氧化、芳香族羥基化和羰基的形成等化學變化[2]。肌原纖維蛋白的存在對肉品質構的形成具有至關重要的作用，并且蛋白質的羰基化和羧基化與肌原纖維蛋白功能受損具有密不可分的聯系[3]。張麗等[4]通過研究肌肉蛋白氧化對肉品質的影響發現，肌紅蛋白是肌肉中的天然組成成分，并被證實可以引發肌肉蛋白的氧化。早有研究證實，高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）是牛肉肌纖維中肌紅蛋白在低氧的情況下Fe2+轉變為Fe3+所形成的一種物質，與此同時，MetMb含量的增加或減少也可以表征牛肉氧化程度的高低[5]。

研究表明，MetMb能夠與H2O2作用產生氧絡合鐵色素和蛋白自由基。Xiong[6]和Ooizumi[7]等通過這種反應建立了模擬MetMb氧化的體系，在此體系中研究了MetMb對肌原纖維蛋白氧化的影響，并發現MetMb氧化體系對肌原纖維蛋白結構的影響很大，尤其是肌球蛋白。并且在與羥自由基氧化體系實驗結果進行分析對比后發現，MetMb氧化體系能誘發更為劇烈的蛋白氧化。研究表明，過氧化氫能夠與MetMb發生反應生成某些肌紅蛋白前體物質，這種前體物質的性質相當不穩定，它能夠以最快速度轉變形成超鐵肌紅蛋白，而這種前體物質與超鐵肌紅蛋白都具有能夠促進肉品中脂質氧化的強大能力[8]。Promeyrat等[9]通過研究發現，肌紅蛋白含量的高低是預測肉品中羰基生成的一個重要的標志，這在一定程度上表明了肌紅蛋白是肌原纖維蛋白羰基化的有效促進劑。Estévez等[10]研究發現，過氧化氫存在條件下，肌紅蛋白比銅離子和鐵離子等金屬離子與過氧化氫的作用更能促進肌原纖維蛋白生成氧化產物，并且研究指出，肌紅蛋白含量的高低可以影響脂肪氧化，與這種影響機理類似的是，在肌紅蛋白氧化過程中會生成H2O2和羥自由基等活性氧物質，而這些物質可以進一步促進蛋白質發生氧化；與此同時，蛋白質的氧化產物MetMb同樣具有促進蛋白質發生氧化的能力。Decker等[11]研究發現，三價鐵與抗壞血酸作用能夠積極地誘導肌原纖維蛋白氧化生成羰基化合物。陳騁[12]對牦牛肉肌紅蛋白穩定性的研究發現，為適應低氧高寒環境，牦牛肉中肌紅蛋白的含量高于平原地區的牛，而由這種特性引起MetMb氧化進而使肌原纖維蛋白發生氧化的研究鮮有報道，有必要對其進行深入探討。

因此，本實驗通過建立MetMb氧化體系，選取甘南牦牛背最長肌，將提取的肌原纖維蛋白于4 ℃氧化孵育24 h，并系統探究氧化系統中蛋白結構的變化，對其生化特性進行研究。根據蛋白結構各指標的變化規律及相互關系比較不同處理組牦牛肉宰后肌原纖維蛋白生化特性的變化，探究MetMb氧化對牦牛肉肌原纖維蛋白生化特性的影響規律，以期為牦牛肉生產加工過程中蛋白氧化控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機選取甘肅甘南藏族自治州同一牧場健康無病的（36±6）月齡牦牛6 頭，平均體質量（250±50）kg。宰后在其左半胴體現場采集背最長肌，在0～4 ℃條件下現場分割成2 cm×2 cm×3 cm長條狀肉樣，錫箔紙包裝，置于液氮罐運輸至實驗室，于超低溫冰箱-80 ℃凍藏待測。

H2O2、三氯乙酸、鹽酸胍、FeCl3、抗壞血酸、溴酚藍、甘氨酸、肌紅蛋白（馬心肌）、牛血清白蛋白、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、哌嗪-N,N′-雙(2-乙磺酸)（1,4-piperazinebis(ethanesulfonic acid)，PIPES）） 天津市光復科技發展有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 美國Sigma公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

XH-B型渦旋混合器 江蘇康健醫療用品有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；756P紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀有限公司；XHF-D型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HX202T電子天平 慈溪市天東衡器廠。

1.3 方法

1.3.1 MetMb氧化模型構建

參考Park等[13]的方法。MetMb溶液濃度分別為0、0.3、0.4、0.5 mmol/L。肌原纖維蛋白分散于上述氧化體系中（最終質量濃度為20 mg/mL，4 ℃氧化24 h后用1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）終止反應。上述氧化反應均在15 mmol/L PIPES緩沖溶液（pH 6.0，0.6 mol/L NaCl）中進行。空白對照為未處理的肌原纖維蛋白。然后通過用pH 7.0的5 倍體積15 mmol/L PIPES緩沖液（無NaCl）洗滌肌原纖維蛋白樣品，1 000×g離心15 min除去氧化劑。將蛋白質沉淀重新懸浮在3 倍體積的含有0.1 mol/L NaCl（pH 7.0）的15 mmol/L PIPES緩沖液中，1 000×g離心15 min，得到肌原纖維蛋白沉淀。蛋白濃度用雙縮脲法測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照Park等[13]的方法略作修改。稱取5 g肉樣，加入10 倍體積標準鹽溶液（20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 6.8），13 000 r/min勻漿10 s，4 ℃、1 000×g離心10 min，并棄去上清液。沉淀用8 倍體積標準鹽溶液溶解后，4 ℃、1 000×g離心10 min，棄去上清液，重復操作2 次。沉淀用8 倍體積的100 mmol/L KCl溶液溶解，然后4 ℃、1 000×g離心10 min，并棄去上清液，重復2 次。最終所得沉淀中加入4 mL 20 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 6.25），用雙縮脲法測定其蛋白質含量。

1.3.3 羰基濃度的測定

參考Levine等[14]的方法，并略作修改。在10 mL的離心管中加入終止氧化后的蛋白質溶液0.5 mL與2 mL 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液，置于25 ℃反應40 min，空白樣品中不加2,4-二硝基苯肼。然后加入20%三氯乙酸溶液2 mL，振蕩后11 000×g離心5 min，倒掉上清液。蛋白質沉淀用乙醇-乙酸乙酯溶液（1∶1，V/V）洗滌3 次，揮發完溶劑后將蛋白質懸浮于3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，于37 ℃水浴保溫30 min，370 nm波長處測定吸光度。以空白為對照，采用分子吸光系數22 000 mol/（L·cm）計算羰基濃度。

1.3.4 巰基濃度的測定

參考Korchak等[15]的方法測定。

1.3.5 二硫鍵濃度測定

參考Thannhauser等[16]的方法，并略作修改。調整蛋白質質量濃度為5 mg/mL。取100 μL稀釋后的蛋白液與3 mL新鮮配制的NTSB溶液混合，在室溫避光反應25 min，然后在412 nm波長處測定吸光度（A）。以0.1 mL 20 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.25）作空白對照。采用分子吸光系數13 600 mol/（L·cm）進行計算。

1.3.6 Ca/K-ATPase活性測定

參考Wells等[17]的方法，并略作修改。反應液A：0.18 mol/L Tris-HCl緩沖液（0.15 mmol/L KCl、15 mmol/L CaCl2、7.6 mmol/L ATP，pH 7.4），測定Ca-ATPase活性。反應液B：0.18 mol/L Tris-HCl緩沖液（7.6 mmol/L ATP、0.3 mol/L KCl、5.0 mmol/L EDTA，pH 7.4），測定K-ATPase活性。用15 mmol/L PIPES（0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將蛋白液稀釋為2 mg/mL，取0.2 mL稀釋液分別與2 mL反應液A或B在25 ℃培養10 min后，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，然后4 ℃、2 500×g離心5 min，取1 mL上清液，加入3.0 mL 0.66%鉬酸銨（溶解在0.375 mol/L硫酸溶液）和0.5 mL新鮮配制的10% FeSO4溶液（溶解在0.075 mol/L硫酸溶液），反應2 min后于700 nm波長處讀數。活性結果表示為μmol/（mg·10 min），0～1.0 mmol/L NaH2PO4溶液制作標準曲線用于磷酸鹽計算。

1.3.7 二聚酪氨酸測定

參考Davies等[18]的方法并略加修改。將含有20 mg肌原纖維蛋白的懸浮液溶于10 mL高離子強度緩沖液（0.6 mol/L，pH 6.0、20 mol/L磷酸緩沖液）中，濾紙過濾除去殘留脂肪和不溶性物質。濾液用雙縮脲法測蛋白含量，用牛血清白蛋白做標準曲線，y = 0.061 3x-0.000 6，x為蛋白質量濃度/（mg/mL），y為吸光度。熒光光度法測定濾液中二酪氨酸含量，測定條件為：發射波長420 nm（狹縫5 nm），激發波長325 nm（狹縫5 nm）。測定結果用熒光強度除以蛋白濃度，表示為相對熒光值。

1.3.8 表面疏水性測定

參考Chelh等[19]的方法測定。

1.3.9 肌原纖維小片化指數（myofibrillar fragmentation index，MFI）的測定

參考Culler等[20]的方法測定。

1.4 數據分析

實驗每個處理重復3 次。采用Microsoft Excel 2010進行數據統計分析，用SPSS 19.0 Duncan法進行數據分析，P＜0.05，顯著差異。

2 結果與分析

2.1 羰基濃度的變化

由圖1可知，經MetMb體系氧化24 h的肌原纖維蛋白羰基濃度呈上升趨勢，當MetMb濃度升高至0.5 mmol/L時，羰基濃度增加至最大值10.11 nmol/mL，較空白對照組升高了近4 倍，與空白對照組（0 mmol/L）2.26 nmol/mL差異顯著（P＜0.05）。可能是因為隨著MetMb濃度的增加，牦牛肉肌原纖維蛋白氧化程度加劇導致的。

圖1 牦牛肉肌原纖維蛋白羰基濃度的變化Fig. 1 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein in yak meat

2.2 巰基濃度的變化

圖2 牦牛肉肌原纖維蛋白巰基濃度的變化Fig. 2 Changes in sulfhydryl content in myofibrillar protein of yak meat

由圖2可知，隨著MetMb濃度的增加，經MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白巰基濃度呈下降趨勢，當MetMb濃度為0.5 mmol/L時，巰基濃度降至41.18 nmol/mL，較空白對照組顯著降低（P＜0.05），下降31.5%。

2.3 二硫鍵濃度的變化

圖3 牦牛肉肌原纖維蛋白二硫鍵濃度的變化Fig. 3 Changes in disulfide bond content in myofibrillar protein of yak meat

由圖3可知，隨著MetMb濃度的增加，經MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白二硫鍵濃度呈上升趨勢，當MetMb濃度為0.5 mmol/L時，二硫鍵濃度與空白對照組相比顯著增加了約3.5 倍（P＜0.05）。肌原纖維蛋白含有大量自由巰基，這些巰基很容易被氧化而轉化成分子內或分子間的二硫鍵，這也是氧化過程中肌原纖維蛋白聚合的主要途徑，綜上，隨著MetMb濃度的增加，肌原纖維蛋白中大量巰基轉換成二硫鍵，蛋白氧化程度加深。

2.4 Ca/K-ATPase活性的變化

圖4 牦牛肉肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性的變化Fig. 4 Changes in Ca-ATPase activity of myo fibrillar protein in yak meat

由圖4可知，隨著MetMb濃度的增加，經MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白Ca-ATPase活性總體呈上升趨勢，MetMb濃度為0.5 mmol/L時，Ca-ATPase活性顯著增加至1.343 μmol/（mg·10 min）（P＜0.05）。ATPase活性是反映肌球蛋白完整性的指標，肌球蛋白頭部催化中心有兩個活性巰基（—SH1和—SH2）。—SH1影響Ca-ATPase活性，而—SH1和—SH2同時影響K-ATPase活性。綜上，在氧化過程中—SH1發生了較大程度的變性。

圖5 牦牛肉肌原纖維蛋白K-ATPase活性的變化Fig. 5 Changes in K-ATPase activity of myo fibrillar protein in yak meat

由圖5可知，隨著MetMb濃度的增加，經MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白K-ATPase活性總體呈下降趨勢。當MetMb濃度為0.5 mmol/L時，K-ATPase活性降低至最低，與空白對照組相比顯著降低36.62%（P＜0.05）。肌球蛋白頭部催化中心的兩個活性巰基（—SH1和—SH2）同時影響K-ATPase活性。綜上，在氧化過程中，—SH1和—SH2均嚴重變性。

2.5 二聚酪氨酸的變化

圖6 牦牛肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸的變化Fig. 6 Changes in dimer tyrosine content of myofibrillar protein in yak meat

由圖6可知，隨著MetMb濃度的增加，相對熒光值呈上升趨勢，在MetMb濃度低于0.01 mmol/L時，其相對熒光值上升緩慢，當濃度增加至0.5 mmol/L時，相對空白對照，相對熒光值增加了近1 倍（P＜0.05）。

2.6 表面疏水性的變化

圖7 牦牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig. 7 Changes in surface hydrophobicity of myofibrillar protein in yak meat

由圖7可知，隨著MetMb濃度的增加，經MetMb體系氧化的肌原纖維蛋白表面疏水性呈上升趨勢。當MetMb濃度為0.5 mmol/L時，溴酚藍結合量較空白對照組增加1 倍左右（P＜0.05）。隨MetMb濃度的增加，蛋白聚集解折疊程度大于其再折疊程度，表面疏水性逐漸增加。

2.7 MFI的變化

圖8 牦牛肉肌原纖維蛋白MFI的變化Fig. 8 Changes in myofibrillar fragmentation index of myofibrillar protein in yak meat

由圖8可知，牦牛肉肌原纖維蛋白在MetMb濃度為0 mmol/L時MFI為23.86，0.5 mmol/L時達最大值55.27。從濃度為0.01 mmol/L開始，MFI呈增加趨勢，顯著小于0.05 mmol/L和0.5 mmol/L時的MFI（P＜0.05）。

2.8 各指標間的相關性分析

通過對MetMb氧化牦牛肉肌原纖維蛋白過程中各指標進行相關性分析，其Pearson相關系數如表1所示。由表1可知，牦牛肉肌原纖維蛋白在MetMb氧化過程中，除羰基濃度與巰基濃度（r=-0.978，P＜0.01）、K-ATPase活性（r=-0.972，P＜0.01）呈極顯著負相關外，與其他指標均呈極顯著正相關。羰基濃度的變化是最能夠表征蛋白氧化程度的指標，結果分析表明各指標均與羰基濃度呈極顯著相關，由此可知MetMb氧化對牦牛肉肌原纖維蛋白的氧化產生了顯著影響。

表1 各指標間的Pearson相關系數Table 1 Pearson correlation coefficients among various indexes

3 討 論

研究發現，肌紅蛋白含量的高低是對肉色深淺最直觀的表征，肌紅蛋白含量越高則肉色越深，而為了適應低氧高寒環境，牦牛肉中肌紅蛋白的含量高于平原地區的牛[12]，因此，有必要對由這種特性引起的MetMb氧化進而對其肌原纖維蛋白氧化產生的影響進行深入探討。Promeyrat等[9]通過對宰后豬肉蛋白氧化研究發現，肌紅蛋白含量增加能夠導致肉中羰基濃度的上升。這與本研究中通過調整MetMb濃度，構建MetMb氧化體系并分析表征蛋白氧化結構和生化特性變化的各指標中，羰基濃度顯著升高這一結果相一致。同時，Savd等[21]通過對宰后豬肉早期肌漿蛋白氧化研究表明，肌紅蛋白是肌原纖維蛋白氧化的有效促進劑。在本研究中，通過各氧化指標間相關性分析的結果發現，牦牛肉肌原纖維蛋白在MetMb氧化過程中其羰基濃度除與巰基濃度、K-ATPase活性呈極顯著負相關外，與其他指標均呈極顯著正相關。這表明在MetMb氧化體系中，牦牛肉肌原纖維蛋白結構發生改變，表征氧化程度的指標對此氧化體系敏感，這可能是由于肌紅蛋白氧化過程中生成的H2O2和羥自由基等活性氧物質進一步促進了蛋白質氧化[22]。李春強[23]研究發現，蛋白氧化過程中，MetMb會在肌肉中積累，并與H2O2反應生成超價態（Fe4+）的肌紅蛋白種類，這類物質可以促進蛋白發生氧化，這與本研究中MetMb促進肌原纖維蛋白發生氧化結果一致。此外，自由基從超價態肌紅蛋白轉移到其他肌肉蛋白上則會生成蛋白自由基并引發蛋白氧化[24-25]，這從深層次確證了本實驗構建MetMb氧化體系導致肌原纖維蛋白發生氧化的理論依據。

本研究中，隨著MetMb濃度升高，巰基濃度逐漸減少，且二硫鍵濃度逐漸增加，當MetMb濃度為0.5 mmol/L時，巰基濃度與空白對照組呈顯著差異（P＜0.05），二硫鍵濃度與空白對照組差異顯著（P＜0.05）。Souza等[8]通過對大鼠額葉皮質中的蛋白氧化研究發現，H2O2還能與MetMb發生反應生成活性中間產物MetMb-H2O2和超鐵（+4價）肌紅蛋白前體物質，這種前體物質極不穩定，可以迅速轉變成超鐵肌紅蛋白，MetMb-H2O2和超鐵肌紅蛋白均具有促進肉中脂質氧化的強大能力，脂質氧化進而促進蛋白氧化，致使巰基濃度減少、二硫鍵濃度增加，這與本實驗結果一致。張麗等[26]研究發現，牦牛肉氧化21 d相比于氧化7 d，其MFI值顯著升高，這與本研究中高濃度（MetMb濃度為0.5 mmol/L）氧化期間MFI值顯著高于對照處理組MFI值結果一致。Irwin等[27]研究表明，與肌紅蛋白介導脂肪氧化類似，肌紅蛋白氧化過程中生成的H2O2和羥自由基等活性氧物質能促進蛋白質氧化；此外，氧化產物MetMb也具有促進蛋白氧化的能力；肌紅蛋白發生解離后，釋放的血紅素和鐵離子同樣具有促進肌原纖維蛋白氧化的能力[28]。本研究中，隨著MetMb濃度升高，溴酚藍結合量呈上升后下趨勢（P＜0.05），蛋白質表面疏水性增加，說明MetMb氧化產生的超鐵肌紅蛋白可以促進蛋白質氧化作用的進行。

4 結 論

經不同濃度MetMb氧化處理的牦牛肉肌原纖維蛋白，隨著MetMb濃度的增加，羰基濃度呈顯著增加趨勢，二硫鍵、表面疏水性和Ca-ATPase活性、二聚酪氨酸、MFI也發生不同程度的增加，巰基濃度和K-ATPase活性均呈現不同程度的降低，巰基在氧化濃度為0.5 mmol/L時下降顯著；K-ATPase活性在高氧化濃度時下降程度更為明顯。MetMb濃度越高，牦牛肉肌原纖維蛋白氧化程度加劇，肌球蛋白頭部活性巰基—SH1和—SH2均嚴重變性。