本土畢赤克魯維酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵葡萄酒的增香潛力分析

張文靜，楊詩妮，杜 爽，姜 嬌，葉冬青*，劉延琳*

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

葡萄酒釀造主要是酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的復雜過程。發(fā)酵過程中，酵母菌種類呈規(guī)律變化，非釀酒酵母和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）之間的相互作用不僅影響發(fā)酵進程，而且對葡萄酒的色澤、香氣、感官質(zhì)量及產(chǎn)品風格的形成都起到至關(guān)重要的作用[1]。葡萄酒工業(yè)發(fā)酵傾向于使用S. cerevisiae以保證葡萄酒發(fā)酵順利進行，但在一定程度上也降低了葡萄酒的風味多樣性。近年來隨著對非釀酒酵母微生物特征和釀造特性的深入研究，其對葡萄酒風味的積極影響廣受關(guān)注[2-4]。畢赤酵母屬酵母具有高產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)的特性，在提高葡萄酒花香及果香特征方面具有極大的應用潛力[2]。畢赤克魯維酵母（Pichia kluyveri）作為其中最受關(guān)注的菌種之一，已有國外公司推出了商業(yè)化的純種發(fā)酵劑[5]，其在各類發(fā)酵產(chǎn)品中的應用不斷被報道。比如，Amaya-Delgado等[6]將P. kluyveri用于龍舌蘭釀造發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的乙醇耐受性和產(chǎn)乙醇能力，且可促進乳酸乙酯的生成；Batista等[7]研究發(fā)現(xiàn)P. kluyveri有利于可可發(fā)酵過程中咖啡風味的形成；Wei Jianping等[8]將P. kluyveri用于蘋果酒發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其能賦予蘋果酒熱帶水果風味。

與S. cerevisiae相比，由于非釀酒酵母在葡萄醪生境中生長緩慢、乙醇轉(zhuǎn)化力較弱，利用非釀酒酵母純種發(fā)酵可能會導致葡萄酒發(fā)酵延滯，因此通常采用混合接種策略，既確保了發(fā)酵的順利進行，又保留了非釀酒酵母的發(fā)酵特征，對葡萄酒香氣質(zhì)量的提升有重要意義[3]。Prior等[9]研究發(fā)現(xiàn)利用P. kluyveri和S. cerevisiae混合接種發(fā)酵可顯著提高葡萄酒中高級醇和乙基酯的含量；Lu Yuyun等[10]研究發(fā)現(xiàn)P. kluyveri和美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）混合接種發(fā)酵可顯著提高榴蓮酒中乙酸乙酯和乙酸異戊酯等物質(zhì)含量；此外，在混合接種策略中，接種比例對葡萄酒質(zhì)量及香氣有顯著影響。楊詩妮等[11]利用戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和S. cerevisiae順序接種混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)接種比例為20∶1時，葡萄酒中揮發(fā)酸含量顯著降低；王倩倩等[12]發(fā)現(xiàn)在同時接種混合發(fā)酵中，高比例接種發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）會顯著降低S. cerevisiae最大生長數(shù)量，且給葡萄酒帶來較強的生青味。Anfang等[13]研究發(fā)現(xiàn)P. kluyveri與S. cerevisiae以1∶9接種比例混合發(fā)酵可顯著增加葡萄酒中果香硫醇的含量。因此，對接種比例進行優(yōu)化是混合釀造工藝中的關(guān)鍵點。

利用具有優(yōu)良釀酒特性的本土酵母有助于塑造葡萄酒的產(chǎn)區(qū)或地域典型性，非釀酒酵母與S. cerevisiae混合發(fā)酵作為當下的研究熱點，是避免產(chǎn)品同質(zhì)化、獲得高品質(zhì)葡萄酒的有效釀造方法[14]。我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)氣候變化多樣，酵母資源極其豐富，而相關(guān)的研究尚處于起步階段。P. kluyveri廣泛存在于葡萄酒自然發(fā)酵前期，能夠促進葡萄酒中酯類物質(zhì)的生成，具有廣闊的應用前景[2]。但目前關(guān)于P. kluyveri對葡萄酒香氣影響的研究還不夠充分，尚鮮見有關(guān)中國本土P. kluyveri與S. cerevisiae混合接種增香釀造的報道。本研究以課題組前期優(yōu)選的本土P. kluyveri HS-2-1[15]和S. cerevisiae NX11424[16]為材料，按照小容器釀造工藝法[17]探究不同接種比例的P. kluyveri對葡萄酒香氣的影響。進一步研究優(yōu)選P. kluyveri的釀造學特性，獲得P. kluyveri與S. cerevisiae混合發(fā)酵釀造赤霞珠干紅葡萄酒的最佳接種比例，旨在為改善國內(nèi)葡萄酒單一風味、提高香氣質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠，2016年購自陜西咸陽瑞那酒莊，初始糖度280 g/L，pH 3.85，總酸4.8 g/L。

P. kluyveri HS-2-1分離自賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵葡萄醪；S. cerevisiae NX11424分離自寧夏產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵葡萄醪，保藏于西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract protein dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、WLN（Wallerstein laboratory nutrient）培養(yǎng)基配制參考文獻[18]，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

乙酸乙酯、癸酸乙酯、異丁醇、苯乙醇和辛酸等標準品（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；BK1301生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭、固相微萃取裝置 美國Supelco公司；6890-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-Innowax色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 小容器發(fā)酵

在2 L發(fā)酵罐中加入約1.5 L葡萄醪，隨后添加60 mg/L SO2和600 mg/L二甲基二碳酸鹽[19]過夜滅菌處理。處理好的葡萄醪先接入HS-2-1，發(fā)酵48 h后以1∶1、10∶1和20∶1的接種比例接種NX11424，其中HS-2-1接種量約為1×106CFU/mL（血球板計數(shù)法），NX11424的接種量按比例計算；以S1、S10、S20表示HS-2-1和NX11424混合接種比例依次為1∶1、10∶1、20∶1。以HS-2-1純種發(fā)酵（PK組）和NX11424純種發(fā)酵（SC組）為對照，發(fā)酵溫度為25 ℃，每個處理設(shè)置3 組重復。

1.3.2 菌落數(shù)檢測

采用稀釋平板計數(shù)法。WLN培養(yǎng)基中添加20 μg/mL氯霉素，排除雜菌生長對酵母菌總菌數(shù)檢測的干擾。在葡萄酒發(fā)酵4 個關(guān)鍵點取樣涂布（發(fā)酵啟動ST1：糖開始下降；旺盛期ST2：二次接種；發(fā)酵后期ST3：糖消耗約3/4；發(fā)酵結(jié)束ST4：糖質(zhì)量濃度低于4.0 g/L）。根據(jù)S. cerevisiae和非釀酒酵母在WLN平板上菌落形態(tài)進行分類統(tǒng)計，其中S. cerevisiae菌落有光澤、乳白色球狀凸起、邊緣規(guī)則；P. kluyveri菌落呈奶油色至灰綠色，表面干燥，中間平坦，邊緣呈放射狀[20]。

1.3.3 理化指標檢測

發(fā)酵過程中每24 h取樣測定還原糖含量，待還原糖質(zhì)量濃度不大于4 g/L且不再降低時加入50 mg/L SO2終止發(fā)酵[17]。發(fā)酵結(jié)束后參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定葡萄酒基本理化指標。

1.3.4 香氣成分測定

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，具體方法參考蔡建等[21]。取5.0 mL葡萄酒加入到15 mL樣品瓶中，同時加入1.0 g NaCl和10 μL的4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標，2.004 g/L）后密封樣品瓶，在40 ℃、180 r/min條件平衡30 min，然后插入萃取頭萃取30 min后進樣，解析8 min。升溫程序為：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min的速率升到220 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，平均線速率為25 cm/s。采用不分流進樣模式，所有質(zhì)譜在電子能量70 eV條件下沖擊，質(zhì)量掃描范圍m/z 29～350。

質(zhì)譜結(jié)果利用計算機譜庫（NIST14）并結(jié)合文獻進行各揮發(fā)性物質(zhì)的定性。對于已有標準品的物質(zhì)，采用外標法定量；沒有標準品的物質(zhì)利用化學結(jié)構(gòu)相似、碳原子數(shù)相近的標準品物質(zhì)的標準曲線進行相對定量[21]。

1.3.5 香氣活性值計算及氣味特征分類

香氣活性值（odour activity value，OAV）由物質(zhì)含量除以其嗅覺閾值得到，本研究中香氣物質(zhì)的嗅覺閾值及香氣描述均引自文獻[21-24]。

根據(jù)文獻[21,25]，將葡萄酒中香氣物質(zhì)按照其氣味特征可分為9組：1=果香，2=花香，3=植物味，4=堅果香，5=焦糖味，6=土腥味，7=化學味，8=脂肪味，9=烘烤味，對所有OAV大于0.1的香氣物質(zhì)進行分組，各組物質(zhì)OAV的總和表示葡萄酒該類香氣輪廓特征。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用One-Way ANOVA法，不同處理供試酒樣中香氣成分分布規(guī)律采用主成分分析（principal component analysis，PCA）；使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵曲線

圖1 不同發(fā)酵處理發(fā)酵曲線Fig. 1 Fermentation curves with different starter cultures

如圖1所示，所有發(fā)酵組均能完成發(fā)酵。SC組最快，歷時7 d，PK組耗時最長，約11 d完成，不同接種比例混合發(fā)酵組（S1、S10、S20）均10 d左右完成發(fā)酵。發(fā)酵前2 d各處理發(fā)酵速率與SC組保持一致。但隨著發(fā)酵進行，發(fā)酵速率呈現(xiàn)明顯差異，SC＞PK＞混合接種發(fā)酵處理（S1、S10、S20）。與SC組相比，P. kluyveri的接入在一定程度上延緩了發(fā)酵進程，這是非釀酒酵母發(fā)酵能力相對較弱的體現(xiàn)[2]。

2.2 發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化

圖2 不同接種處理發(fā)酵中P. kluyver與S. cerevisiae菌株在不同階段的數(shù)量變化Fig. 2 Populations of P. kluyver and S. cerevisiae at different stages of fermentation

圖2 為在不同發(fā)酵處理中4 個關(guān)鍵時期S. cerevisiae和P. kluyveri的菌落數(shù)變化。整體看，S. cerevisiae和P. kluyveri的菌落數(shù)在發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。由于接種比例的不同，混合發(fā)酵處理酒樣中NX11424的生長受到不同程度的抑制。與SC組相比，混合發(fā)酵處理酒樣中NX11424的最大增殖量和發(fā)酵結(jié)束后菌落數(shù)均降低，不同接種比例處理之間發(fā)酵結(jié)束后S. cerevisiae的菌落數(shù)無明顯差別，這與Fleet等[1]的研究結(jié)果一致。發(fā)酵過程中酵母菌之間存在競爭作用，隨著發(fā)酵的進行，生長能力及耐受性更強的S. cerevisiae迅速占據(jù)主導地位，處于弱勢地位的P. kluyveri菌落數(shù)下降較快。本實驗中HS-2-1菌落數(shù)在ST2開始劇烈下降。此外，混合發(fā)酵處理中HS-2-1的最大增殖量和發(fā)酵結(jié)束后菌落數(shù)均顯著高于PK組，且S10組的最大增殖量最高（1.30×108CFU/mL），這可能與不同種屬酵母之間存在生長協(xié)同作用有關(guān)[26]，二者的互作關(guān)系有待進一步研究。實驗結(jié)果表明，HS-2-1在葡萄酒釀造過程中具有良好的定植能力，在整個發(fā)酵過程中均能保持一定的生物量水平。混合接種不會影響乙醇發(fā)酵的正常進行，且在一定程度上能減緩HS-2-1的衰亡。

2.3 理化指標分析

表1 發(fā)酵結(jié)束后酒樣的基本理化指標Table 1 Chemical composition of wines at the end of fermentation

如表1所示，所有處理都完成了乙醇發(fā)酵，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度均低于4 g/L，乙醇體積分數(shù)約為13%。相較于SC組，其他處理酒樣中總酸含量升高，揮發(fā)酸含量降低，其中PK組酒樣總酸質(zhì)量濃度最高（6.44 g/L），S1組酒樣揮發(fā)酸質(zhì)量濃度最低（0.25 g/L）。這可能由于菌株HS-2-1具有嗜殺特性[15]，研究表明嗜殺酵母能夠有效抑制發(fā)酵過程中腐敗微生物的生長，凈化發(fā)酵體系，從而降低揮發(fā)酸含量[27]。

2.4 香氣成分分析

對發(fā)酵后葡萄酒樣進行香氣分析，共檢測到46 種物質(zhì)，包括16 種高級醇類物質(zhì)、19 種酯類物質(zhì)、6 種脂肪酸類物質(zhì)以及5 種其他物質(zhì)（表2）。各處理間香氣物質(zhì)組成種類沒有顯著差異，但物質(zhì)含量存在顯著差異。

高級醇是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)，總質(zhì)量濃度超過400 mg/L時，會帶來強烈的刺鼻味，而低于300 mg/L時，可以增加香氣復雜性[28]。各處理酒樣中高級醇質(zhì)量濃度均低于300 mg/L。與SC組相比，混合發(fā)酵處理（S10、S20）酒樣中高級醇總量顯著升高，其中S20組酒樣中高級醇總量最高（176.92 mg/L），提高了24.19%。這與王倩倩等[12]在P. fermentans中的研究結(jié)果相似，混合發(fā)酵處理中高比例接種P. fermentans提高了葡萄酒中高級醇類物質(zhì)含量，而這與非釀酒酵母的存活數(shù)量及存活時間密切相關(guān)[29]。2-苯乙醇可為葡萄酒帶來玫瑰香等愉悅香氣[30]，本研究發(fā)現(xiàn)高比例接種P. kluyvei的酒樣中2-苯乙醇含量顯著提高，其中PK組酒樣中2-苯乙醇質(zhì)量濃度最高（8.27 mg/L）。一般認為非釀酒酵母具有更高的苯乙醇產(chǎn)生能力[3]，如Andorrà等[30]研究發(fā)現(xiàn)與S. cerevisiae純種發(fā)酵相比，假絲酵母（Candida zemplinina）純種發(fā)酵能顯著提高葡萄酒中2-苯乙醇含量，從而使得其高級醇含量顯著增高。在檢測到的醇類物質(zhì)中，只有異戊醇含量超過感官閾值，是葡萄酒主要香氣貢獻物質(zhì)[21]。與SC組相比，PK組酒樣中異戊醇含量顯著升高，提高21.26%。混合發(fā)酵處理酒樣中只有高比例接種處理（S10、S20）酒樣中異戊醇含量顯著提高，其中S20組物質(zhì)含量最高，提高38.31%。此外余歡等[31]發(fā)現(xiàn)巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）純種發(fā)酵能夠提高葡萄酒中癸醇含量，給葡萄酒帶來橙子花香。本實驗也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，PK組酒樣中癸醇含量較其他處理顯著提高，3 組混合發(fā)酵處理葡萄酒中癸醇含量也較SC組顯著提高，且其含量隨著P. kluyveri接種比例的升高而降低。

酯類物質(zhì)是葡萄酒果香和花香的主要貢獻者[28]。前人研究表明畢赤酵母屬酵母具有高產(chǎn)酯類物質(zhì)的特性[3]。本實驗中，與SC組相比，3 組混合發(fā)酵處理酒樣中酯類物質(zhì)總量均顯著提高，且隨著P. kluyvei所占比例的增加，酯類物質(zhì)增幅越大。其中S20組酒樣酯類物質(zhì)總量為74.08 mg/L，較SC組中酯類物質(zhì)總量高出21.34%。這與Escribano等[32]報道畢赤酵母屬酵母具有高酯酶活性的結(jié)果一致。在檢出的19 種酯類物質(zhì)中，丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯5 種物質(zhì)的OAV均大于1，對所得酒樣香氣的貢獻更為顯著[21]。檢出19 種酯類物質(zhì)，其中有5 種物質(zhì)OAV大于1，分別為丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯。與SC組酒樣相比，不同比例混合發(fā)酵處理均可促進以上5 種酯類物質(zhì)的合成，有利于葡萄酒果香和復雜性的增強[31]。其中，己酸乙酯具有最高的OAV（15.08～17.19），可以給葡萄酒帶來濃郁的草莓、菠蘿香氣[21]。S20組酒樣己酸乙酯質(zhì)量濃度最高（429.73 μg/L），為SC組的1.06 倍，但S1、S10組與SC組間差異不顯著。Chua等[33]發(fā)現(xiàn)P. kluyvei在豆腐乳清發(fā)酵中能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸異戊酯含量，賦予其香蕉香氣，這與本研究結(jié)果一致。此外乳酸乙酯能賦予葡萄酒特殊的乳香風味[32]，與SC組相比，PK組酒樣中乳酸乙酯含量較低，但混合發(fā)酵過程中乳酸乙酯含量顯著增加，其中S20組酒樣中乳酸乙酯含量最高（26.38 mg/L），為SC組（13.12 mg/L）的2.01 倍，這可能是因為混合發(fā)酵過程中酵母之間的互作促進了乳酸乙酯的生成。相關(guān)

研究表明，葡萄酒中香氣物質(zhì)的生成在非釀酒酵母與S. cerevisiae共發(fā)酵體系中存在協(xié)同作用[34]。

表2 不同發(fā)酵處理葡萄酒的香氣成分Table 2 Volatile compounds identified from wines fermented with different starter cultures

葡萄酒中的脂肪酸能夠抑制對應芳香酯的水解，有利于葡萄酒香氣的平衡。其中低濃度脂肪酸能賦予葡萄酒奶酪、奶油風味，但含量過高時會給葡萄酒帶來刺激、腐敗等不良風味[28]。本實驗檢出的6 種脂肪酸含量均低于感官閾值，有利于提高葡萄酒的復雜性[28]。與SC組相比，各處理脂肪酸總量均降低，特別是各混合發(fā)酵處理中丙酸、異丁酸、異戊酸的含量均顯著降低，這與Lu Yuyun等[35]利用P. kluyvei和T. delbrueckii混合發(fā)酵榴蓮酒的結(jié)果一致。

在檢出的其他物質(zhì)中，β-大馬士酮能夠貢獻葡萄酒中的甜香、花香和蜂蜜香[32]。本實驗中該物質(zhì)在3 組混合發(fā)酵處理中含量較高，均超出感官閾值，但在SC組酒樣中并未檢測到，這可能與非釀酒酵母可產(chǎn)生較多的利于水解香氣前體物質(zhì)的糖苷酶相關(guān)[2]。

圖3 干紅葡萄酒發(fā)酵香氣成分在前2 個主成分上的載荷及酒樣分布圖Fig. 3 Loading plot of wine aroma components on the first two PCs

為進一步判別不同處理之間香氣成分的差異，對所有發(fā)酵香氣成分進行PCA，結(jié)果如圖3所示。在PCA模型中，PC1（40.66%）和PC2（39.69%）的累計方差貢獻率為80.35%，能夠反映樣本的大部分信息。3 組混合發(fā)酵處理均位于PC1方向正端，其酒樣中辛酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯等香氣物質(zhì)含量豐富，而SC組位于PC1方向負向端，酒樣中香氣物質(zhì)含量相對較少。PC2可將混合發(fā)酵處理（S1、S10、S20）酒樣與PK處理酒樣顯著區(qū)分，主要貢獻物質(zhì)為己酸異戊酯、1-辛醇和3-甲基-1-戊醇等。由此可知P. kluyvei和S. cerevisiae混合發(fā)酵改變了純種發(fā)酵時的呈香特征。

對酒樣中OAV大于0.1的物質(zhì)進行香氣分組，選取∑OAV大于0.5的6 種香氣類型繪制得到葡萄酒的香氣輪廓圖（圖4）。所有實驗酒樣香氣均以果香為主，其次為花香、焦糖味、脂肪味、化學味、植物味。相較于SC組酒樣，接種P. kluyvei的葡萄酒樣中果香、花香及焦糖味均有顯著提高。這與混合發(fā)酵顯著提高了樣品中酯類、醇類及β-大馬士酮等物質(zhì)含量有關(guān)。植物味、脂肪味及化學味在低濃度條件有利于提升香氣復雜度[21]，所有處理中植物味和化學味強度無顯著差別，但混合接種處理中脂肪味強度略有上升，這是由于混合發(fā)酵處理提高了葡萄酒中異戊醇、乳酸乙酯等物質(zhì)的含量。

圖4 不同發(fā)酵處理干紅葡萄酒發(fā)酵香氣輪廓Fig. 4 Aroma profile of red wines produced with different tarter cultures

3 結(jié) 論

隨著對非釀酒酵母釀造特性研究的深入開展，其在改善葡萄酒風味中的積極貢獻被不斷挖掘，與S. cerevisiae混合發(fā)酵作為有潛力的工藝措施也得到了廣泛的關(guān)注。本研究選擇本土P. kluyveri HS-2-1與S. cerevisiae NX11424以不同比例順序接種釀造赤霞珠干紅葡萄酒，發(fā)現(xiàn)HS-2-1和NX11424以20∶1比例接種，在確保乙醇發(fā)酵順利完成的同時，能夠最大限度地發(fā)揮P. kluyveri的產(chǎn)香特性，顯著提高發(fā)酵酒樣中己酸乙酯、丁酸乙酯等乙基酯類物質(zhì)含量，使葡萄酒的果香和花香顯著增強。因此，本研究認為本土P. kluyveri HS-2-1具有增香釀造葡萄酒的應用潛力。在后續(xù)研究中，將進一步細化其與S. cerevisiae的互作關(guān)系及對葡萄酒品質(zhì)指標的全面影響，以期為葡萄酒增香釀造工藝技術(shù)的研發(fā)提供重要理論依據(jù)。