人源重鏈鐵蛋白純化及其納米粒制備

夏小雨，李 晗，王震宇，譚曉怡，程述震，杜 明,*

（1.大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

自然界中存在著一類具有天然籠形結構的蛋白質，其在結構上具有良好的對稱性、穩定性和運載性，近年來逐漸吸引研究者關注。將籠形蛋白中心的物質去除可形成中空的蛋白籠，通常粒徑較小的晶體單質分散蛋白載體被稱為蛋白質納米籠[1]。這類結構可以為它所包封的物質提供良好的保護并改善被包封物質的性質[2]，常見的有病毒衣殼、熱休克蛋白和鐵蛋白（ferritin，Fn）。蛋白質納米籠作為遞送載體具有明顯優勢[3]：一是其存在于生物體，因而有良好的生物相容性、生物降解性和生物安全性；二是其籠狀結構唯一且有良好的穩定性和均一性[4]；三是蛋白質本身的活性基團可通過改性賦予蛋白新功能或增強靶向性[5-6]；四是氨基酸組成多樣決定了其可包封的物質多樣[7-9]。

Fn是一種廣泛存在于生物體內具有儲鐵和調節鐵平衡功能的蛋白質，可作為吸收利用率極高的生物補鐵源[10]。Fn納米籠具有保守的結構，即由24 個亞基組成432 點對稱的十二面體球形結構，外徑12 nm，內徑8 nm，空腔可形成鐵核，具有良好的熱穩定性（＞70 ℃）等優良特性[11]；Fn能夠簡單通過調節體系pH值（＜2或者＞11）實現自我可逆解聚與重組裝，為納米載體系統的建立提供了條件；Fn受體大量存在于人體內的各種器官及屏障組織中，如脾臟、肝臟等[12]，使Fn復合納米顆粒的運送、靶向識別及胞內釋放成為可能。Fn的空腔最多可貯存4 500 個鐵原子，天然Fn可以作為一種鐵補充劑，隨著部分Fn可耐受胃環境而被小腸的專一受體吸收的機制逐漸被廣泛認同[13]，Fn在作為礦質元素和有機小分子營養強化劑載體上的潛力逐漸顯現。Li Meiliang等[14]證明載鈣的Fn可被Caco-2細胞吸收，且鈣由于免受體系外膳食因子干擾而吸收率顯著提高；Chen Lingli等[15]將β-胡蘿卜素包進Fn，實現了油溶性活性物在水體系中的穩定存在；Zhang Tuo等[16]驗證了Caco-2細胞對Fn-花青素的吸收，這些充分說明Fn作為可食生物納米載體和營養強化劑具有可實現性和安全性，具有良好的應用價值。

大量分離純化高純度的Fn是生物納米運載體系研究的前提和基礎。然而，目前Fn的制備通常采用搖瓶培養含Fn基因的工程菌株的方法[17-19]，雖蛋白質表達效率高但經純化后獲得的純品量仍然有限，嚴重限制了其廣泛應用。因此，本研究采用原核表達系統于發酵罐內高效表達人源重鏈鐵蛋白（recombinant human H-chain ferritin，rHuHF），進而對攪拌轉速、空氣通量及誘導表達時間3 個關鍵工藝參數進行優化，確定大量表達目的蛋白質的最佳表達條件，以多技術組合的方法分離純化獲得具有可逆自組裝特性的rHuHF純品。采用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和動態光散射（dynamic light scattering，DLS）對rHuHF的納米結構及粒徑進行表征，DLS、紫外光譜、熒光光譜鑒定rHuHF的可逆自組裝活性，以期為基于可逆自組裝蛋白納米運載系統的研究及開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

重組rHuHF原核表達工程菌株BL21-pET3arHuHF（該菌株攜帶人H鐵蛋白基因，其NCBI登錄號為NM002032.3）、感受態大腸桿菌菌株JM109和BL21（DE3）由本實驗室制備保存；原核擴增質粒pMD18-T、原核表達質粒pET3a載體 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 試劑

試劑盒Prime Script? 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6110A）、San Prep柱式DNA膠回收試劑盒、pMD18-T載體聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物快速連接試劑盒、TaKaRa LA Taq?PCR試劑盒（RR002A）、寶生物T4 Ligation試劑盒日本TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素溶液（ampicillin，AMP）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris） 上海生工生物工程有限公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250、溴酚藍 美國Sigma公司；SDS電泳Marker、Native電泳Marker、弱陰離子高流速瓊脂糖凝膠（DEAE）Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司；10 kDa超濾管 德國Millipore公司；醋酸鈾上海阿拉丁公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 儀器與設備

2720 Thermal Cycler PCR擴增儀 美國應用生物系統公司；AE-8135垂直電泳 日本ATTO公司；MF-Chemi BIS2.0凝膠成像系統 以色列DNR公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RLPHR1-4真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；H-7650 TEM 日本日立公司；3D-DLS型動靜態光散射儀 瑞士LSI公司；Milli Q Plus 185超純水凈化系統 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 rHuHF的mRNA提取

用棉簽刮取人口腔內壁表皮細胞，蘸入1.5 mL離心管內1 mL超純水中，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，取沉淀作為mRNA提取原料，向沉淀中加入1 mL Trizol，室溫放置1 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液至新的1.5 mL離心管中，向上清液中加入0.2 mL預冷的氯仿，旋渦混合器劇烈振動15 s，室溫放置10 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取最上層清液于新的1.5 mL離心管中。向最上層清液中加入0.5 mL預冷的異丙醇，輕輕搖勻至出現乳白色絮凝，室溫放置10 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，留片狀沉淀。加入1 mL體積分數70%乙醇洗滌片狀沉淀，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄去清液。將洗滌操作進行2～3 次重復，將片狀沉淀自然晾干。向沉淀中加入100 μL超純水，用微量光吸收酶標儀測A260nm/A280nm和提取的mRNA濃度（即模板mRNA）。根據瓊脂糖凝膠水平電泳儀操作方法電泳，進行28S、18S、5S條帶驗證。

1.3.2 pET3a-rHuHF載體構建

引物及rHuHF蛋白原核表達載體構建參考Zou Wenyan等[20]的方法，略有改動。采用試劑盒Prime Script?1st Strandc DNA Synthesis Kit（6110A）進行反轉錄過程，將mRNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，根據NCBI網站查看目的基因序列（NM002032.3），設計引物序列，上游引物序列：5’-catatgacgaccgcgtccacctcg-3’（下劃線為NdeI酶切位點），下游引物序列：5’-gaatt cttagctttcattatcactgtc-3’（下劃線為EcoRI酶切位點，加粗體為插入的終止密碼子），擴增rHuHFDNA，PCR條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 次循環；72 ℃延伸10 min。將目的基因與pMD18-T載體連接，經瓊脂糖凝膠水平電泳驗證擴增結果和DNA膠回收后，分別將插入rHuHF基因的pMD18-T質粒與空載質粒pET-3a用NdeI/EcoRI雙酶切，T4DNA連接酶連接酶切后片段，得重組質粒pET3arHuHF。將重組質粒pET3a-rHuHF熱激轉化到克隆菌株JM109中擴增，經有氨芐青霉素的瓊脂平板篩選后進行菌液PCR和瓊脂糖凝膠水平電泳驗證擴增結果，委托蘇州泓迅生物科技有限公司測序鑒定，結果與NCBI網站GenBank比對。

1.3.3rHuHF誘導表達及發酵條件優化

將通過測序驗證的重組質粒pET3a-rHuHF轉化到工程菌株BL21（DE3）中，搖菌培養并做電泳條帶驗證，得到轉化成功的工程菌株BL21-pET3a-rHuHF，-80 ℃條件下甘油保藏菌株。

采用恒溫搖床培養（500 mL體系）與發酵罐發酵（3 500 mL體系）2 種方式比較蛋白表達量差異，驗證發酵罐表達目標蛋白的穩定性和高產性。將工程菌BL21-pET3a-rHuHF活化，以4%的體積分數接種于含工作濃度AMP的LB液體培養基中，置于37 ℃、200 r/min搖床培養10 h，獲得種子液，再以5‰的體積分數種入新的含工作濃度AMP的LB培養基中。在分別對發酵罐攪拌轉速、發酵罐空氣通量及誘導表達時間進行單因素試驗的基礎上，控制其他因素保持不變，改變發酵罐攪拌轉速、空氣通量和誘導表達時間（表1），針對以上3 個因素進行IPTG誘導表達的正交試驗[21]，確定最佳表達條件。發酵過程中每隔1 h取樣檢測菌液濃度（OD600nm）及菌液pH值變化，當OD600nm值接近為1.0時，加入IPTG溶液至終濃度0.1 mmol/L[22]，表達結束得發酵菌液。

表1 rHuHF表達條件正交試驗因素與水平Table 1 Independent variables ad their levels used in experimental design for optimization of rHuHF expression conditions

1.3.4rHuHF表達位置鑒定

發酵菌液8 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離培養液和菌體沉淀，用等質量的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）重懸菌體，置于冰浴中進行超聲細胞破碎，功率300 W，每超聲3 s停4 s，總時長15 min，10 000 r/min、4 ℃離心10 min分離上清細胞可溶物和細胞不溶物，再以緩沖液洗滌細胞不溶物2 次并入上清細胞可溶物溶液，以未導入含rHuHF基因載體的BL21（DE3）菌株作為對照，將分離各部分溶液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定rHuHF蛋白的表達位置，8 個樣品的總蛋白質量濃度為1 mg/mL，上樣量均為5 μL，膠配方和電泳方法參照Wu Chao等[23]的方法。目的蛋白存在于細胞上清液，表明蛋白為可溶性表達；目的蛋白存在于胞內沉淀則為包涵體表達。在此基礎上對比搖床培養與發酵罐發酵兩種方式所得目標蛋白的可溶性比例，驗證發酵罐表達目標蛋白的穩定性，搖床培養樣品總蛋白質量濃度均為1 mg/mL，上樣量為20 μL。

1.3.5 rHuHF純化及純度鑒定

取含rHuHF的溶液以60 ℃水浴加熱10 min，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液加60%飽和度的(NH4)2SO4，4 ℃磁力攪拌40 min后靜置6 h，離心取沉淀并用等質量的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）重懸。采用3 500 Da透析袋以50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）透析3 次，每6 h換一次透析液，用0.45 μm濾膜過濾，采用SDS-PAGE和Native-PAGE檢驗蛋白表達強度，BCA法測定蛋白濃度。將rHuHF粗蛋白溶液進行弱陰離子交換層析-凝膠過濾層析。弱陰離子交換層析以50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）平衡DEAE-Sepharose Fast Flow柱，上樣后以含1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長280 nm，SDS-PAGE分析純度。Superdex200分子篩層析以50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）平衡分子篩并洗脫，流速1 mL/min，檢測波長280 nm，分離單體和多聚體rHuHF，單體溶液以10 kDa超濾濃縮除鹽，凍干得到黃色固體絮狀粉末。

1.3.6 rHuHF納米結構觀察

rHuHF純品的透射電鏡制樣過程參考Zheng Bowen等[24]的方法。使用JEM-2100（UHR）TEM以200 kV在50 nm比例尺下拍攝0.5 μmol/L rHuHF蛋白的負染結構成像，成像經過了至少3 次獨立的平行觀測且每次均在5 個以上區域進行觀察。

1.3.7 rHuHF粒徑表征

rHuHF的粒徑以DLS測定并擬合得到，0.5 μmol/L rHuHF蛋白溶液過0.2 μm水系濾膜，在樣品溫度20 ℃（室溫）、測試角度90°條件下連續測定8 h，獲得良好的衰減曲線，利用LSI correlator acquisition軟件分析得出rHuHF的水動力粒徑分布，進行3 次平行測定以避免偶然性。

1.4 統計分析

運用Origin 9.0軟件進行數據處理分析，所有數據均經過3 次及以上平行實驗。

2 結果與分析

2.1 工程菌BL21-pET3a-rHuHF誘導表達可溶性Fn

圖1 rHuHF蛋白發酵罐內表達過程的OD值（A）和pH值（B）變化Fig. 1 Changes in OD value (A) and pH (B) during the expression of rHuHF protein in the fermentation tank

通過擴增得到的rHuHF基因全長為552 bp，編碼183 個氨基酸，蛋白分子質量為504 kDa。由圖1A可知，工程菌BL21-pET3a-rHuHF在發酵罐內培養過程中菌體量呈近似對數增長，培養液渾濁度逐漸上升，OD600nm逐漸增加。由圖1B可以看出，新配制的滅菌LB培養基自然pH值約為6.0，培養期間菌液pH值經短暫的小幅下降后持續上升到發酵結束時的8.0左右。對發酵結束的菌液進行培養液和菌體分離、菌體細胞可溶物（細胞破碎上清液）與不溶物（細胞破碎沉淀）分離，通過SDS-PAGE鑒定目標蛋白的表達位置。

圖2 鑒定發酵罐發酵rHuHF蛋白在大腸桿菌BL21中表達位置的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE pto file for the position identi fication of rHuHF protein expression in E. coli BL21 cultured in fermentation tank

圖3 鑒定搖瓶法所得rHuHF蛋白在大腸桿菌BL21中表達位置的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE pro file for the position identi fication of rHuHF protein expression in E. coli BL21 cultured in shaking flask

由圖2可知，1、2泳道對比可證明發酵液中幾乎沒有蛋白質存在；與未導入pET3a-rHuHF重組質粒的大腸桿菌BL21（泳道3）相比，工程菌BL21-pET3a-rHuHF（泳道4）在接近20.1 kDa的位置明顯多出了一種不屬于大腸桿菌BL21本身的蛋白表達條帶，說明目標蛋白表達在菌體細胞內部且表達量較高；泳道4和泳道5、6（細胞破碎沉淀）對比可知，導入重組質粒前后的細胞破碎沉淀所含蛋白種類有略微差別，目標蛋白大部分未在細胞破碎沉淀內表達；對比泳道4和泳道7、8（胞內可溶物）可知，導入重組質粒的細胞破碎上清液所含蛋白種類有明顯增加，泳道8出現目標蛋白條帶，綜上所述，目標蛋白大部分表達在胞內可溶物部分，為可溶性表達。

采用搖瓶法培養與發酵罐發酵對比驗證發酵罐表達目標蛋白的穩定性，由圖3可以看出，搖瓶法表達的目標蛋白分布在菌體胞內可溶部分和菌體胞內不溶物部分。圖2、3比較可知，發酵罐表達目標蛋白比搖瓶表達更易產出可溶性形式，原因可能是發酵罐表達條件更加穩定可控，更利于可溶性目標蛋白產出。

2.2 rHuHF蛋白發酵罐誘導表達條件的優化

為了提高rHuHF蛋白的誘導表達量，對發酵罐發酵培養工程菌BL21-pET3a-rHuHF的關鍵工藝參數進行優化。前期對表達過程的條件進行了單因素試驗，并考慮節約發酵過程的能耗，本實驗選擇工程菌株培養溫度37 ℃、罐內攪拌轉速150～250 r/min、空氣通量0.8～1.6 L/min、加入IPTG后誘導表達時間8～10 h作為優化范圍，所選條件范圍內目標蛋白的誘導表達量較多，通過BCA試劑盒定量比較出平均每升發酵液表達目標蛋白量得出最優參數。因為OD600nm值為1.0時，工程菌的生長進入到平臺期[25]，生長速度趨緩，所以選擇此時加入誘導劑IPTG，有研究已證明提高大腸桿菌BL21（DE3）的誘導劑終濃度后，雜蛋白表達量也增加[26]且IPTG對細菌有一定毒性[27]，故誘導劑IPTG的終濃度確定為0.1 mmol/L。由表2可知，第7次試驗所得每升菌液的目標蛋白含量最高，因素優組合為攪拌轉速200 r/min、空氣通量1.6 L/min、誘導表達9 h，且空氣通量為最主要影響因素，故從節約能源和盡量獲得目標蛋白考慮，選擇試驗的中等攪拌轉速。綜上所述，選擇攪拌轉速200 r/min、空氣通量1.6 L/min、誘導表達9 h為最佳表達條件。

所進行的9 次發酵中每升發酵液的rHuHF表達量最高可達約290 mg/L（表2），采用最佳條件進行搖床培養所得rHuHF表達量約為190 mg/L，相比之下，發酵罐發酵表達目的蛋白的得率顯著提高，具有較高的表達效率。Zou Wenyan等[20]在發酵表達過程中共表達了可產生分子伴侶的pG-Tf2載體因子輔助增強菌體內的正確折疊率和可溶性表達量，rHuHF純度在90%以上時的產量為15 mg/L，說明本研究構建的工程菌和采用的發酵條件在目標蛋白表達產量上與相關研究比較[28-29]具有明顯優勢。

表2 rHuHF誘導表達條件優化正交試驗設計與結果Table 2 Experimental design with results for optimization of rHuHF expression conditions

2.3 rHuHF蛋白的純化

圖4 DEAE弱陰離子交換層析（A）和Superdex200分子篩層析（B）Fig. 4 DEAE anion exchange chromatogram (A) and Superdex200 molecular sieve chromatogram (B)

采用熱處理法、沉淀法及透析法結合提取菌體細胞上清液中的粗rHuHF蛋白，經過SDS-PAGE和Native-PAGE驗證目標蛋白。以預先優化的弱陰離子交換層析洗脫梯度及分子篩條件進行DEAE弱陰離子交換層析和Superdex200分子篩層析檢測到的純化過程曲線如圖4所示。從圖4A可以看出，NaCl溶液占流動相比例為20%時洗脫出的峰為目標蛋白峰，其保留體積為180.38 mL，且與其他峰較好地分離，洗脫的rHuHF約占上柱前總蛋白的96%；圖4B中保留體積41.18 mL處為目標蛋白峰單體，其左右兩個小峰為其多聚體。由圖5可得，弱陰離子交換層析純化出的目標蛋白達到了電泳純度且只由相對分子質量接近20 kDa的單亞基構成，與其他研究所述一致[30]，由圖6可知，rHuHF在pH 7.5體系內幾乎被純化至均質，表觀相對分子質量約440 kDa，目標蛋白條帶上方濃度較低的大分子蛋白可能是單體rHuHF蛋白的多聚體形式。綜上可說明rHuHF的純化情況良好，純度達到電泳純。

圖5 經過弱陰離子交換層析rHuHF蛋白的SDS-PAGEFig. 5 SDS-PAGE for identification of rHuHF by weak anion exchange chromatography

圖6 經過弱陰離子交換層析rHuHF蛋白的Native-PAGEFig. 6 Native-PAGE for identification of rHuHF by weak anion exchange chromatography

2.4 rHuHF納米結構觀察及粒徑表征

圖7 rHuHF透射電鏡負染結構圖Fig. 7 TEM image of rHuHF

將純化所得單體rHuHF蛋白進行TEM負染成像。從圖7可以看出，純化所得rHuHF蛋白具有良好的單分散性和完整的納米球狀結構，與圖例的觀測尺寸對比可得rHuHF納米籠的外徑小于10 nm，與報道的Fn外徑尺寸相接近[31]，由于醋酸鈾負染色液通過通道進入Fn腔內，Fn內部充滿醋酸鈾染液，故在腔內可見黑色的鈾核，與其他研究現象一致[32]。由圖8A可知，經DLS測定并擬合得到的rHuHF粒徑為（11.23±0.10）nm，粒徑分布窄且均一性較強，與已報道的Fn外徑12 nm基本相符[30,33]，rHuHF溶液在體系pH值為2時擬合得出的水動力半徑為（2.73±0.10）nm（圖8B），說明大分子rHuHF納米籠在pH 2環境下發生解離，從圖8C可看出，rHuHF在pH值重新恢復到7后復性，其粒徑恢復至（12.03±0.10）nm，紫外和熒光特性均與變性復性前沒有明顯區別（圖8D、E），說明rHuHF在這一過程中保持有良好的可逆解聚和重聚合能力，由于擬合所得水動力半徑與H單亞基的寬度和厚度（2～2.5 nm）相接近卻小于H亞基的長度，說明極端pH的解離環境可能對蛋白結構有一定的破壞，與Zhang Shengli等[34]的研究結果一致。

3 討 論

構建BL21-pET3a-rHuHF原核表達系統和制備rHuHF主要有兩個原因：1）在cDNA文庫中，Fn重鏈基因被鑒定為一種高表達基因，其在菌體生長和表達蛋白的后期不會發生水平下調，rHuHF在表達及分離純化過程中的產量遠遠高于天然Fn[25]；2）rHuHF是H亞基的均聚體，其在體內有確定的受體TfR1[35-36]，因此rHuHF在體內的穩定性和識別性均有所增強，而且rHuHF的結構和其他化學性質與天然Fn相同，為后續Fn包埋及靶向遞送系統的研究奠定基礎。為探究rHuHF的高效制備技術，本研究構建了重組質粒pET3a-rHuHF，將其轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中進行原核表達。由于重組蛋白在原核表達系統中過表達時往往傾向于形成包涵體，條件優化有助于提高重組蛋白的可溶表達量，因此通過優化發酵罐表達rHuHF的關鍵參數獲得了最佳發酵條件，從結果明顯可以看出表達的rHuHF包涵體形式很少，而且目標蛋白產量顯著高于搖瓶法表達量和相關研究報道的表達產量[20]，推測原因是罐內發酵條件可控性強、發酵條件穩定，接下來會對發酵表達過程繼續研究，通過嘗試添加共培養因子[37-39]等方式促進目標蛋白在工程菌內的正確折疊，進一步增加有效目標蛋白得量。這一過程可為開發Fn作為新型營養補充劑和Fn納米載藥系統的研究工作奠定一定的基礎。

以所建立和優化的DEAE弱陰離子交換層析洗脫條件可純化出電泳純的rHuHF蛋白，極大縮短了rHuHF蛋白的純化時間，且通過TEM、DLS以及變性和非變性電泳的表征可看出純化的rHuHF蛋白具有完整球形結構、良好的單分散性和穩定性以及正確的相對分子質量和粒徑大小，DLS、UV光譜、熒光光譜顯示其具有良好的可逆自組裝活性，從發酵菌液中純化rHuHF的步驟為進一步提高蛋白純化效率的研究提供了參考。

4 結 論

本研究優化發酵罐高效表達rHuHF的關鍵工藝參數，得到的最佳表達條件為攪拌轉速200 r/min、空氣通量1.6 L/min、表達時間9 h，發酵表達量最高可達290 mg/L；TEM顯示表達的單分散性均一rHuHF直徑尺寸接近10 nm，rHuHF在pH 7時水動力粒徑為（11.23±0.1）nm，pH 2時水動力粒徑為（2.73±0.1）nm。本研究對基于可逆自組裝Fn的納米靶向運輸系統的研究及開發等工作具有重要意義。