石榴皮渣果膠電解水提取工藝及其結構特性

王煒清，莊 虎，王康平，王 萍，李述剛,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.塔里木大學生命科學學院，南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

石榴（Punica granatum L.）為石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）植物，其果實營養豐富，并具有較高的食用、藥用價值[1]，是一種集社會、經濟、生態效益和觀賞價值與保健功能于一身的特色經濟作物。工業生產中，石榴主要用于果汁、果酒的釀造，期間產生了大量以石榴皮渣為主的加工副產物。據報道，每噸新鮮石榴水果能產生669 kg副產物，其中含78%果皮和22%石榴籽[2]。隨著石榴產業的飛速發展，石榴皮渣的浪費情況日趨嚴重，對環境的壓力也越來越大，現僅有少量文獻對石榴皮渣進行研究[3]，其中果膠作為石榴皮渣中大量存在的天然成分，具備安全，無毒等特點，乳化性[4]、凝膠性[5]等性質優良，因此被廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域。

近年來，國內外眾多學者對果膠的提取工藝技術進行了大量研究，主要有酸提法[6]、酶提取法[7-8]、高壓脈沖電場技術[9]、微波法[10]、亞臨界水提取法[11]、離子交換法[12]等。提取方法通常需要使用大量強酸調節提取環境的pH值，因此對環境造成極大的破壞，且提取得率受到限制。超聲輔助提取是通過利用超聲波在液體介質中傳播時會形成大量的空化泡，空化泡驟裂時釋放出的巨大能量可對細胞結構產生破壞，使材料與溶劑的接觸面積大大增加，有效提高了目標物向溶劑的轉移[13-14]。電解水是指在特殊裝置中通過采用無隔膜電解方式電解稀溶液所得到的功能性水[15]。酸性電解水（pH＜2.5）具有較強的氧化性和殺菌效果，且價格低廉、綠色環保、安全無毒，在食品、醫藥、農業等領域廣泛研究與應用[16]。目前，利用超聲與酸性電解水相結合提取果膠的方法鮮見報道。

基于以上分析，本實驗擬采用石榴皮渣作為研究對象，在超聲輔助下，以弱酸性電解水為提取溶劑，對果膠的提取工藝進行研究。考察pH值、料液比、提取溫度、提取時間以及超聲功率密度等因素對石榴皮渣果膠提取得率的影響，通過響應面法優選果膠的提取工藝，并利用傅里葉變換紅外光譜等手段對提取物的結構進行測定分析，以期為石榴皮渣果膠的高效綠色提取及制備提供理論依據，促進其果膠的深加工和高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮甜石榴樣品來源于中國新疆維吾爾自治區和田市。石榴樣品去除果肉后，果皮和果渣烘干磨粉后冷凍備用。

電解水（pH 5.0） 深圳市潤正電解技術有限公司；果膠酶（200 U/mL） 丹麥Novozymes公司；咔唑美國阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Multifuge高速冷凍離心機、Nicoletis-5傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ICS-500高效陰離子交換色譜美國Dionex公司；凝膠滲透色譜與多角度激光光散射聯用儀（分析系統由Shodex OHpak SB-G型保護柱、ShodexOHpak SB-805型分離柱、515 HPLC型泵和檢測器組成；檢測器由DAWNHELEOS型多角度激光光散射儀（砷化鎵光源，激光波長658 nm）、SPD-10Av型紫外檢測器（檢測波長280 nm）和Optilabr EX型示差折光檢測器（激光波長658 nm）組成） 美國Wyatt技術公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠的提取及含量測定

準確稱取10 g石榴皮渣，與一定比例的酸性電解水充分混合，使用1 mol/L HCl溶液調節pH值，在超聲波條件下提取（超聲頻率40 kHz）。首先趁熱將提取液紗布過濾，5 000 r/min離心10 min后收集上層提取液。使用2 倍體積的乙醇在4 ℃條件下沉淀果膠4 h。再將沉淀的果膠凝膠在4 ℃條件下以8 000 r/min離心10 min。凍干、磨粉得到果膠粉末。

采用NY/T 2016—2011《水果及其制品中果膠含量的測定 分光光度法》咔唑-硫酸法測定D-半乳糖醛酸含量，以表示果膠含量。分別取1 mL D-半乳糖醛酸標準溶液（0、20、40、60、80、100 μg/mL）加入到25 mL具塞試管中，繼續添加0.25 mL咔唑-乙醇溶液，連續搖動試管，并迅速加入5 mL濃硫酸。將試管在85 ℃水浴鍋中保持20 min，取出后置于冷水中冷卻。在525 nm波長處測定吸光度，以半乳糖醛酸質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線方程為Y=0.011 9X+0.003 8，R2=0.997 5。將果膠提取液稀釋到一定質量濃度，按照標準曲線步驟操作，根據式（1）計算果膠提取得率：

式中：C為半乳糖醛酸質量濃度/（μg/mL）；V為果膠提取液總體積/mL；N為提取液稀釋倍數；W為樣品質量/g。

1.3.2 石榴皮渣果膠的提取工藝優化

1.3.2.1 單因素試驗

研究提取時間（20、30、40、50、60 min）、提取溫度（30、40、50、60 、70 ℃）、超聲功率密度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 W/mL）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））和pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）5 個因素對石榴皮渣果膠提取得率的影響，其中各因素固定水平為提取時間30 min、提取溫度60 ℃、超聲功率密度1.0 W/mL、料液比1∶20 （g/mL）、pH 2.0。

1.3.2.2 響應面試驗

以果膠提取得率為評價指標，根據單因素試驗結果，固定超聲功率密度為1 W/mL，以pH值、提取時間、提取溫度、料液比為考察因素，確定因素和水平（表1），采用Design-Expert軟件，應用Box-Behnken原理進行4因素3水平試驗（共29 組），從而確定提取的最優條件。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.3 果膠分子質量的測定

凝膠滲透色譜與多角度激光光散射聯用表征果膠分子質量，參考Liao Hua等[17]的方法。用去離子水配制0.2 mol/L的NaCl溶液，添加0.02% NaN3以防止微生物的生長。用0.22 μm尼龍微孔濾膜抽濾3 次，超聲除去氣泡后作為流動相備用。準確稱取一定量的樣品溶于流動相中，使果膠樣品終質量濃度為0.2 mg/mL。置于滾軸混合器上搖勻備用。進樣前樣品用0.22 μm的尼龍微孔濾膜過濾，進樣量200 μL，流速0.45 mL/min，實驗溫度25 ℃，dn/dc值為0.131 mL/g。數據分析軟件為ASTRA5.3.4.14，分析方法為Berry。

1.3.4 酯化度測定

參考Pinheiro等[18]的方法對果膠酯化度進行測定。準確稱取0.1 g果膠，用1 mL乙醇濕潤，加入1 g NaCl，用超純水溶解定容至100 mL。酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至顏色變成粉紅色（pH 7.5），且30 s不變色。記錄所用NaOH的體積為V1。然后向溶液中加入15 mL 0.25 mol/L NaOH溶液，室溫攪拌30 min后加入15 mL 0.25 mol/L鹽酸溶液，然后用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至粉紅色，30 s不變色。記錄所用NaOH體積為V2。酯化度按式（2）計算：

1.3.5 果膠的單糖組成測定

果膠的水解：用去離子水溶解2 mg/mL的果膠樣品，在40 ℃水浴鍋內保溫，滴加1 mL果膠酶保溫24 h，再加入1 mL 6 mol/L H2SO4溶液沸水浴2 h。冷卻后用NaOH調節pH值為中性，稀釋一定程度后樣品過0.22 μm濾膜后備用。

采用高效陰離子交換色譜層析法-脈動電流探測法探究石榴皮渣果膠的單糖組成。測試條件：Carbo PacPA-1分離柱（內徑4 mm，柱長250 mm）；流動相A為250 mmol/L NaOH，B為1 mol/L NaAc，C為去離子水；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積25 μL。在積分脈沖安培檢測器中，Au為工作電極，Ag/ACl為參比電極。

中性單糖和糖醛酸的淋洗梯度程序如下：5 mmol/L NaOH（0～20 min），5～100 mmol/L NaOH（20～30 min），100 mmol/L NaOH、0～100 mmol/L CH3COONa（30～50 min），200 mmol/L NaOH（50～60 min）。

1.3.6 果膠紅外光譜掃描

將干燥的果膠粉末（約2 mg）與溴化鉀以質量比1∶250混勻研磨后壓片通過傅里葉變換紅外光譜。從溴化鉀樣品盤中以4 000～400 cm-1的范圍進行64 次掃描以4 cm-1的分辨率獲得光譜。

根據果膠酯化度與式（3）中酯基峰面積百分比建立標準曲線，根據標準曲線測定果膠的酯化度[19]。

式中：I為酯基峰面積百分比/%；A1742為甲酯基吸收峰面積；A1630～1600為羧酸鹽吸收峰面積。

1.4 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化試驗的作圖及分析，采用Origin 2017軟件作圖及分析數據。

2 結果與分析

2.1 提取工藝的單因素試驗結果

如圖1a所示，隨著提取時間的延長，石榴皮渣果膠提取得率呈現出先升高后降低的趨勢，在提取時間為30 min時達到最大值，可能由于提取時間過短，果膠不能充分溶出；提取時間過長，在熱效應與超聲條件下，可能會造成部分果膠發生雙重降解[20]。因此選用提取時間20、30 min和40 min 3 個水平進行響應面試驗優化。

如圖1b所示，隨著提取溫度的升高，石榴皮渣果膠提取得率增大，在提取溫度為60 ℃時達到最大，繼續升高溫度提取得率沒有明顯的變化。在一定提取溫度范圍內，溫度升高果膠的提取得率增加，這是由于溫度較高時，細胞壁和表皮組織比較松弛，使得原果膠可以更快的轉化為水溶性果膠，提高果膠提取得率，而溫度過高會使果膠發生降解[21]，提取得率和果膠品質均會受到影響。因此選擇提取溫度50、60 ℃和70 ℃ 3 個水平用于響應面試驗優化。

如圖1c所示，果膠提取得率隨著超聲功率密度的增加，呈先上升后減小的趨勢，在超聲功率密度1.0 W/mL時提取得率最大，這是因為在超聲功率密度過低時，石榴皮果膠提取不完全，而當超聲功率密度過高時，果膠會發生降解，影響果膠提取得率[22-23]。超聲功率密度在0.8～1.6 W/mL時對果膠提取得率影響較小，故在響應面試驗優化中不考慮此因素，并選擇超聲功率密度為1.0 W/mL。

圖1 提取因素對果膠提取得率的影響Fig. 1 Effect of extraction parameters on pectin yield

如圖1d所示，果膠提取得率隨溶劑用量的增加呈先增加后減少的趨勢，在料液比為1∶20（g/mL）時達到最大值。在溶劑用量增大的過程中，石榴皮渣果膠提取得率逐漸增大是因為在較小的溶劑用量條件下，原材料中的果膠難以完全轉移到提取液中，溶液黏度大，果膠殘余多，提取不完全，而在溶劑用量過大時，提取液中果膠可能被部分水解，且提取液的體積增加，果膠濃度減小，增加了后續工藝的難度[24]。因此選用料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）3 個水平用于響應面試驗優化。

如圖1e所示，石榴皮渣果膠提取得率隨pH值的升高呈先增大后減小的變化趨勢，這是由于果膠是一種酸性多糖，一定程度上的酸度增強有助于原果膠的水解，使更多的原果膠轉化為水溶性果膠，從而提升果膠提取得率，但當pH＜1.5時，果膠的提取得率會緩慢下降，溶于水溶液中的果膠在強酸性條件下發生脫酯裂解，從而使果膠提取得率下降[25]。pH值的變化對石榴皮渣果膠的提取得率有很大的影響，選擇pH 1.5、2.0、2.5用于響應面試驗優化。

2.2 提取工藝的響應面試驗優化分析

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

綜合單因素試驗，選取對石榴皮渣果膠提取得率影響較大的pH值（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）4 個因素，建立4因素3水平Box-Behnken試驗設計（表1），共包括29 個試驗方案，24 個分析試驗點，5 個中心試驗點，用以計算試驗誤差。石榴皮渣果膠提取的響應面分析結果見表2。對響應值和各個因素進行二次多元回歸擬合，該模型對應的回歸方程為石榴皮渣果膠提取得率：

2.2.2 回歸模型的方差分析

為了確定響應面試驗設計中4 個因素對果膠提取得率的影響，以及各個因素的交互作用和顯著性，通過F統計量、響應面二次多項式模型的方差分析（ANOVA）檢驗回歸模型的顯著性，見表3。失擬項通常用以描述回歸模型的合適程度，考察沒有在回歸范圍內被包含的數據點。本研究中，模型失擬項的F值為5.960，P值為0.050 1（＞0.05），表明失擬項不顯著，說明該模型擬合度較好。一次項A、D對模型的影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2和D2為顯著（P＜0.05），交互項均不顯著。從F值可看出各因素對響應值的影響程度，得到提取因素的主效應關系為A＞D＞C＞B，即pH值＞料液比＞提取溫度＞提取時間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.3 響應面試驗分析

圖2 石榴皮渣果膠提取得率與各因素的響應面圖Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effect of various extraction parameters on pectin yield

如圖2所示，pH值、提取時間、提取溫度及料液比中任意2 個變量取0水平時，其余變量對果膠得率的影響，三維響應面的形狀都與拋物線圖形相似，說明果膠提取得率的最大值出現在中間點處，此模型存在最大值的穩定點。二維等高線的形狀可反映因素間交互效應的強弱，中心圓越趨于橢圓形則表示2 個因素交互效果顯著，而越趨于圓形則相反[20,26]。由圖2可知，A（pH值）與B（提取時間）和D（料液比）與B（提取時間）的等高線圖形呈較為扁的橢圓形，而其他的橢圓偏圓形，與方差分析相吻合。即BD與AB的交互作用對果膠提取得率影響更大。降低pH值可以使果膠和半纖維素之間的連接斷裂，釋放果膠分子，從而增加提取溶劑中果膠的含量[25]，而料液比影響提取液的黏度和果膠的擴散速度，使原料中的果膠完全轉移到提取液中，減少膠質殘留[24]，在適當的提取時間下，更多的果膠分子溶解在提取液中，進而增加果膠的提取率[20]。

2.2.4 模擬驗證實驗

表4 電解水與超純水提取果膠實驗對比Table 4 Comparison between electrolyzed water and UP water used for solvent extraction of pectin

通過對石榴皮渣果膠提取得率的二次多項數學模型進行解析，得出提取石榴皮渣果膠的最佳工藝條件為超聲功率密度1.0 W/mL、pH 1.67、料液比1∶17.87（g/mL）、提取溫度60.09 ℃、超聲時間32.14 min，此時，石榴皮渣果膠的提取得率理論上可達到14.48%。考慮到實際操作性，調整工藝參數為超聲功率密度1.00 W/mL、pH 1.7、提取溫度60 ℃、提取時間33 min、料液比1∶18（g/mL）。在此條件下進行3 組驗證實驗，石榴皮渣果膠的提取得率分別為14.71%、15.09%、15.06%，平均值為14.95%，與理論值接近，表明數學模型對優化石榴皮渣果膠的提取工藝可行。并在此基礎上對比研究同等條件下超純水提取石榴皮渣果膠的提取得率結果如表4所示，根據對比實驗可以看出同等條件下電解水提取果膠的得率高于超純水提取，在2 種提取方法均得到相同果膠提取得率結果時，只需調節電解水pH值至2.0。相比超純水提取法，鹽酸的使用量降低了15%，這在降低成本、綠色環保方面也有突出貢獻。

2.3 果膠的理化性質和結構分析

2.3.1 分子質量

圖3 不同提取方法下果膠的分子質量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of pomegranate peel pectin extracted by different methods

不同提取方法得到的果膠在結構和功能性質方面存在較大差異。由圖3可以看出，2 種果膠的分子質量分布均為雙峰分布，推測可能是2 種方法所提取的果膠為粗果膠，其中還含有少量色素、蛋白質以及小分子物質等，但還有待下一步驗證。電解水提取果膠的mw為7.294×106g/mol，比超純水提取果膠（9.977×106g/mol）低26.89%，表明電解水提取比傳統超純水提取法具有更明顯的降解效果。而超純水提取果膠的多分散系數（1.156）較電解水提取果膠的多分散系數（1.169）低1.11%，表明超純水提取果膠分子分布更集中。

2.3.2 果膠單糖組成與提取得率

使用電解水作提取溶劑制備的石榴皮渣果膠不僅提取得率高于超純水，二者的單糖組成也存在較大差異。果膠主要是由以半乳糖醛酸（GalA）為主鏈的線型鏈構成，其中部分區域被L-鼠李糖（Rha）打斷并連有其他中性糖側鏈（主要是D-半乳糖（Gal）和L-阿拉伯糖（Ara））[27]。而GalA是構成果膠中同型半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖（rhamnogalacturonan，RG）區域的主要成分[28]，占電解水提取果膠和超純水提取果膠單糖中的絕大部分，其中電解水提取果膠的GalA含量達到了GB 25533—2010《食品添加劑 果膠》的要求（≥65%）。Rha與GalA物質的量比表示果膠主鏈的變化，由表5可知，電解水提取果膠與超純水提取果膠的主鏈無明顯差異。而（Gal+Ara）/Rha反映了RG-I區域側鏈的平均長度，超純水提取果膠略高于電解水提取。同時，2 種果膠相對應的其葡萄糖（Glu）相對含量（10.61%）僅為超純水所提取的1/2。產生這種現象的原因有可能是電解水所提取果膠將其中的部分支鏈水解，導致電解水提取果膠有著更高的半乳糖醛酸含量和酯化度，且側鏈長度較低。

2.3.3 果膠紅外光譜分析

圖4 不同提取方法下果膠紅外光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of pectin extracted by different methods

如圖4所示，2 種方法制備果膠的紅外圖譜相似，其中3 500～3 000 cm-1處的吸收峰是O—H的伸縮振動引起的；3 000～2 800 cm-1處的特征峰是由半乳糖醛酸甲酯或碳環上的C—H的伸縮振動引起的，1 760～1 730 cm-1處的峰為果膠羧羰基和酯羰基中C＝O的伸縮振動，1 630～1 600 cm-1處的峰為果膠羧基中COO-的振動引起的；由于果膠的酯化度與其在1 742 cm-1處的峰面積與1 742 cm-1和1 626 cm-1處的峰面積之和的百分比呈線性關系[19,29]，由樣品在1 742 cm-1和1 626 cm-1處的峰面積可知電解水提取果膠的酯化度（68.4%）高于超純水提取果膠（59.1%），該結果與化學測定法得出的結果吻合。

3 結 論

本實驗從石榴工業生產廢棄物石榴皮渣的再利用出發，研究了石榴皮渣果膠的提取方法并獲得最佳電解水提取工藝。通過比較2 種提取方法制備的石榴皮渣果膠，發現以弱酸性電解水作為提取溶劑能夠提高提取得率，且果膠具有更高的半乳糖醛酸含量以及較低的分子質量，并通多傅里葉變換紅外光譜顯示了電解水提取果膠具有更高的酯化度。因此，利用電解水提取法可減少強酸的使用量[30]，緩解其對環境的破壞，是一種綠色高效的石榴皮渣果膠提取方法。