基于Fe3O4-PGA@Au 構(gòu)建無(wú)酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)葡萄糖

關(guān)樺楠，龔德?tīng)睿?巖，劉 博，韓博林，楊 帆，崔琳琳，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

目前，用于葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器多依賴(lài)于其核心元件葡萄糖氧化酶的活性[1-3]。葡萄糖氧化酶為天然蛋白質(zhì)酶，可特異性催化底物葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。通過(guò)測(cè)定催化反應(yīng)過(guò)程中電子遷移所產(chǎn)生的電信號(hào)構(gòu)建葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器[1]。但是葡萄糖氧化酶成本較高，穩(wěn)定性較差且固載技術(shù)復(fù)雜，使得此類(lèi)型的生物傳感器應(yīng)用時(shí)受到一定的限制[4]。

近年來(lái)，伴隨著納米模擬酶研究的發(fā)展，模擬酶已成為催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-8]。相比于天然酶，納米模擬酶具有成本低、穩(wěn)定性高、可循環(huán)使用和催化活性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。在新興的葡萄糖氧化酶納米模擬酶中，金屬硫化物（MoS2）[9]、金屬氧化物（Co3O4、V2O5、CeO2和Mn3O4）[5]、碳納米材料（石墨烯、富勒烯和碳納米管）[7]、磁性粒子（Fe3O4）[10-12]和貴金屬粒子（Au、Ag和Pt）[12-14]吸引了諸多學(xué)者的關(guān)注；其中，磁性納米材料以其易回收和可循環(huán)利用的特點(diǎn)與具有良好催化活性的貴金屬納米材料相結(jié)合，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12-15]。

圖1 Fe3O4-PGA@Au 納米材料的制備過(guò)程（A）和電極修飾及檢測(cè)葡萄糖原理示意圖（B）Fig. 1 Schematic illustration of Fe3O4-PGA@Au nanocomposite fabrication process (A), electrode modi fication and electrooxidation of glucose (B)

本研究中，采用聚谷氨酸（poly-(γ-glutamic acid)，PGA）作為還原劑和交聯(lián)劑，一步法自組裝制備具有核殼結(jié)構(gòu)的新型金磁微粒（Fe3O4-PGA@Au），具體過(guò)程如下：采用天然PGA綠色還原法制備Fe3O4-PGA微粒（圖1A-a），利用柑橘提取液綠色制備金納米粒子，并通過(guò)自組裝技術(shù)制備Fe3O4-PGA@Au納米粒子（圖1A-b）。PGA是一種水溶性多聚氨基酸，其結(jié)構(gòu)為谷氨酸單元通過(guò)α-氨基和γ-羧基形成肽鍵的高分子聚合物，具有很強(qiáng)的生物相容性[16-18]。通過(guò)PGA的交聯(lián)作用，此粒子結(jié)合了磁性粒子和貴金屬納米粒子的優(yōu)勢(shì)，具有良好的模擬酶催化活性、高穩(wěn)定性和易回收的特點(diǎn)，可催化底物葡萄糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)。采用新型金磁微粒修飾玻碳電極，構(gòu)建了葡萄糖檢測(cè)的無(wú)酶型電化學(xué)生物傳感器（圖1B-c），所獲得的傳感器針對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出良好的電催化性能，在催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫的過(guò)程中形成明顯的電化學(xué)氧化峰（圖1B-d）。該類(lèi)型無(wú)酶?jìng)鞲衅鞅憩F(xiàn)出良好的靈敏度，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果將為食品、藥品和環(huán)境成分檢測(cè)與分析技術(shù)的改良提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水氯化鐵、三水乙酸鈉、PEG-4000、葡萄糖天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；PGA、氯金酸 美國(guó)Sigma公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒 上海市德賽診斷系統(tǒng)有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MAGNA-IR560E.S.P傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)ULVCA-PHI公司；BT-9300H激光粒度分布儀 美國(guó)惠普公司；9600振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì) 美國(guó)LDJ Electronics公司；CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中國(guó)上海申順生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4-PGA@Au的制備與表征

金納米粒子的制備參考本課題組前期工作[19]，采用橘皮提取液快速合成。Fe3O4-PGA微粒采用一步綠色水熱還原法制備，具體流程如下：稱(chēng)量0.8 g的FeCl3·6H2O粉末和0.1 g的PGA粉末，分散于60 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min；將整個(gè)體系移至水熱反應(yīng)釜中，在180 ℃條件下反應(yīng)6 h；將反應(yīng)得到的黑色懸浮液分別用乙醇和去離子水清洗2 次，70 ℃條件下真空干燥5 h，獲得的黑色粉末即為Fe3O4-PGA。采用去離子水配制Fe3O4-PGA粒子懸浮溶液（100 mg/mL），向20 mL懸浮溶液中加入20 mL金納米粒子溶膠，渦旋振蕩2 min；用磁鐵在側(cè)壁吸附固定體系中的固體，棄去上清液，采用去離子水清洗固體2 次，冷凍干燥，即獲得Fe3O4-PGA@Au；4 ℃保存，備用。采用振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定Fe3O4-PGA@Au的磁學(xué)性質(zhì)，采用X射線衍射圖譜和傅里葉變換紅外光譜對(duì)合成的復(fù)合微粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.3.2 無(wú)酶葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建

采用金相砂紙拋光玻碳電極（GCE，直徑3 mm），在去離子水中超聲清洗20 min，然后將電極置于強(qiáng)酸混合液（硝酸-鹽酸-水（1∶3∶4，V/V））中浸泡10 min，再在去離子水中超聲清洗20 min。將預(yù)處理后的玻碳電極浸置于Fe3O4-PGA@Au懸浮溶液（100 mg/mL）中，靜置2 min（恒電位為3.0 V），使玻碳電極表面吸附有帶有負(fù)電荷的金磁微粒，再用去離子水柔和清洗玻碳電極，用以去除游離的雜質(zhì)；將吹干后的電極再次浸置于Fe3O4-PGA@Au懸浮溶液（100 mg/mL）中，靜置2 min，此為Fe3O4-PGA@Au-GCE無(wú)酶型電化學(xué)生物傳感器，室溫靜置備用。

1.3.3 無(wú)酶生物傳感器檢測(cè)葡萄糖條件的優(yōu)化

電化學(xué)測(cè)定在CHI660e型電化學(xué)工作站上進(jìn)行，采用三電極體系：鉑電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，修飾的玻碳電極為工作電極。利用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法測(cè)定無(wú)酶生物傳感器檢測(cè)葡萄糖時(shí)氧化峰電流，通過(guò)峰電流強(qiáng)度評(píng)估并優(yōu)化檢測(cè)體系的參數(shù)。分別考察檢測(cè)溫度、檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)pH值和掃描速率對(duì)檢測(cè)體系的影響。將1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到15 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.2）中，將Fe3O4-PGA@Au-GCE浸入反應(yīng)體系中，采用NaOH調(diào)節(jié)體系pH值為7.2～8.2，維持總體積16 mL，葡萄糖濃度為0.01 mmol/L，在不同水浴溫度條件下（30～55 ℃）孵育不同的時(shí)間間隔（5～30 min），設(shè)置不同的掃描速率（20～70 mV/s），根據(jù)結(jié)果篩選最佳檢測(cè)參數(shù)。

1.3.4 葡萄糖的檢測(cè)

使體系中葡萄糖濃度分別為0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0 μmol/L和100.0 μmol/L，采用Fe3O4-PGA@Au-GCE，根據(jù)優(yōu)化后的體系參數(shù)，利用CV法檢測(cè)不同濃度葡萄糖的峰電流強(qiáng)度，觀察CV曲線變化。將峰電流強(qiáng)度換算為峰電流密度（即玻碳電極表面有效單位面積的電流強(qiáng)度（Id，μA/cm2），以峰電流密度為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度（C，μmol/L）為橫坐標(biāo)構(gòu)建工作曲線，其中葡萄糖濃度分別設(shè)置為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00 μmol/L和1 000.00 μmol/L；選擇食品中常見(jiàn)的糖類(lèi)作為參照（0.1 mmol/L，高于對(duì)照樣品中葡萄糖濃度10 倍），評(píng)估葡萄糖（0.01 mmol/L）檢測(cè)體系的抗干擾性能；測(cè)定葡萄糖0.01 mmol/L和0.1 mmol/L兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，采用所構(gòu)建的工作曲線確定該體系的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

選擇常見(jiàn)水果（紅富士蘋(píng)果和臍橙）作為實(shí)際樣品模型，并對(duì)樣品進(jìn)行必要的前處理。將水果樣品分別去皮去籽后，充分粉碎攪拌至糊狀；再取該糊狀樣品1 g加入到20 mL錐形瓶中，并加入雙蒸水10 mL，超聲振蕩15 min后，離心去沉淀，將上清液用的微孔濾膜過(guò)濾（0.45 μm）一次；采用葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定初始葡萄糖濃度；再向樣品上清液中添加不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1、0.5、1.0 mmol/L），采用Fe3O4-PGA@Au-GCE無(wú)酶?jìng)鞲衅鳒y(cè)定其電化學(xué)行為，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次。基于所構(gòu)建的工作曲線計(jì)算實(shí)際樣品體系中的葡萄糖終濃度，考察檢測(cè)體系對(duì)實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，采用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe3O4-PGA@Au的表征

圖2 納米粒子的透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig. 2 TEM images of Fe3O4-PGA nanoparticles (A and B), gold nanoparticles (AuNPs) (C) and Fe3O4-PGA@Au nanoparticles (D)

由圖2A、B可知，制備的Fe3O4-PGA粒子平均粒徑約為290 nm，呈現(xiàn)近似圓球形的顆粒；在黑色的Fe3O4核心外壁包覆有一層透明薄膜，厚度約為10 nm，初步判斷為PGA層。金納米粒子的透射電子顯微鏡圖見(jiàn)圖2C，金納米粒子粒徑約為4 nm，多由圓球型和圓棒型粒子組成。由圖2D可知，在Fe3O4-PGA粒子透明層表面吸附有大量的金納米粒子。Fe3O4-PGA@Au微粒的X射線衍射、傅里葉變換紅外光譜和磁學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。

從圖3A可知，基于JCPDS 19-0629卡，衍射峰（111）和（311）對(duì)應(yīng)Au；衍射峰（220）、（311）、（400）、（511）、（422）和（440）對(duì)應(yīng)Fe3O4，說(shuō)明Fe3O4-PGA@Au微粒中含有Au和Fe3O4。其中，（111）和（311）對(duì)應(yīng)的衍射峰2θ為38.56°和77.58°[20-22]。Fe3O4衍射峰所對(duì)應(yīng)的2θ為30.17°、35.54°、43.27°、53.62°、57.11°和62.85°，表明微粒中的Fe3O4為立方反尖晶石結(jié)構(gòu)，具備良好的電磁性能[23]。

Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au的傅里葉變換紅外光譜圖譜見(jiàn)圖3B，F(xiàn)e3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au兩種微粒在578 cm-1處都出現(xiàn)Fe—O振動(dòng)的吸收峰；同時(shí)，在1 610、1 659 cm-1和2 938 cm-1處都出現(xiàn)吸收峰，分別對(duì)應(yīng)C＝C、C＝O和C—H鍵，這幾個(gè)化學(xué)鍵都來(lái)自于PGA的制備和修飾[16,24]。此外，F(xiàn)e3O4-PGA在3 457 cm-1處具有明顯的吸收峰，對(duì)應(yīng)氨基基團(tuán)中的N—H，PGA作為一種天然的多聚氨基酸具有豐富的氨基基團(tuán)[25]；而Fe3O4-PGA@Au中3 457 cm-1所對(duì)應(yīng)的N—H峰強(qiáng)度變?nèi)酰f(shuō)明金納米粒子已通過(guò)氨基與Fe3O4-PGA充分吸附[25]。Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au的磁學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，兩種納米粒子飽和磁化值分別為62.7 emu/g和42.3 emu/g，說(shuō)明金納米粒子的吸附弱化了磁核的磁性。

圖3 Fe3O4-PGA@Au X射線衍射（A）和傅里葉紅外光譜（B）圖Fig. 3 X-ray diffraction pattern (A) and Fourier transform infrared spectrum (B) of Fe3O4-PGA@Au nanoparticles

2.2 Fe3O4-PGA@Au-GCE檢測(cè)體系的參數(shù)優(yōu)化

由圖4A可知，峰電流強(qiáng)度隨掃描速率逐漸增大，當(dāng)掃描速率超過(guò)50 mV/s后，峰電流強(qiáng)度逐漸下降，可能是較高的掃描速率時(shí)，修飾電極出現(xiàn)極化現(xiàn)象，形成暫態(tài)，影響了峰電流強(qiáng)度[26]。

從圖4B可知，檢測(cè)時(shí)間為15 min時(shí)，峰電流強(qiáng)度最高。此催化反應(yīng)的產(chǎn)物中含有過(guò)氧化氫，其自身可以水解產(chǎn)生微弱電流；長(zhǎng)時(shí)間催化所積累的過(guò)氧化氫會(huì)干擾電極對(duì)葡萄糖的識(shí)別性能，進(jìn)而造成峰電流強(qiáng)度的下降。檢測(cè)葡萄糖的模擬酶的催化反應(yīng)需要在弱堿環(huán)境中完成；且當(dāng)體系中出現(xiàn)OH-時(shí)，葡萄糖分子易聚集于電極附近，降低葡萄糖氧化的活化能，使其更容易被氧化，因此設(shè)置pH值范圍為7.2～8.2[27]。從圖4C可見(jiàn)，當(dāng)檢測(cè)體系的pH值為7.8時(shí)，峰電流強(qiáng)度最高；當(dāng)pH值繼續(xù)升高，反應(yīng)受到抑制，峰電流強(qiáng)度開(kāi)始下降。從圖4D可知，最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)溫度繼續(xù)提升，峰電流強(qiáng)度開(kāi)始下降，原因可能是溫度過(guò)高會(huì)造成電極表面金磁微粒的基底效應(yīng)，引致修飾層的剝離，影響了峰電流強(qiáng)度[28]。綜上，選擇最佳檢測(cè)條件為掃描速率50 mV/s、檢測(cè)時(shí)間15 min、pH 7.8和反應(yīng)溫度40 ℃。

圖4 掃描速率（A）、檢測(cè)時(shí)間（B）、體系pH值（C）和反應(yīng)溫度（D）對(duì)Fe3O4-PGA@Au-GCE無(wú)酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)葡萄糖的影響Fig. 4 Effect of scan rate (A), detection time (B), pH value (C) and reaction temperature (D) on detection of glucose using Fe3O4-PGA@Au-GCE non-enzymatic sensor

2.3 Fe3O4-PGA@Au-GCE檢測(cè)葡萄糖體系的構(gòu)建

基于優(yōu)化后的檢測(cè)體系，采用CV法評(píng)估葡萄糖無(wú)酶檢測(cè)體系的電化學(xué)響應(yīng)性能，并構(gòu)建葡萄糖檢測(cè)的工作曲線。由圖5可知，當(dāng)體系中沒(méi)有葡萄糖時(shí)，CV曲線沒(méi)有出現(xiàn)明顯的氧化峰和還原峰；當(dāng)體系中加入葡萄糖（0.1 μmol/L）時(shí)，在0.15 V處出現(xiàn)氧化峰，說(shuō)明電極表面的金磁微粒可以替代葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖水解產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，該過(guò)程形成電信號(hào)，出現(xiàn)氧化峰；當(dāng)體系中葡萄糖的濃度逐漸增大，氧化峰的電流強(qiáng)度也逐漸提高[29-30]，葡萄糖濃度為100 μmol/L時(shí)，峰電流強(qiáng)度達(dá)到最大值-27.3 μA。由圖5可知，葡萄糖濃度C與峰電流密度Id在兩段濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，與其他的研究類(lèi)似[12,29]。在葡萄糖濃度范圍為0.1～5.0 μmol/L時(shí)，峰電流密度回歸方程為Id=2.95C+57.37，R2=0.978 5；在10～250 μmol/L時(shí)，峰電流密度回歸方程為Id=0.118 9C+81.61，R2=0.984 5，檢出限為0.74 μmol/L（RSN=3）。結(jié)果表明，回收率在96%～107%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3%～5%之間，符合檢測(cè)要求（12%以下）[30]。采用Fe3O4-PGA@Au-GCE所構(gòu)建的無(wú)酶葡萄糖檢測(cè)傳感器具有較高的靈敏度和重復(fù)性。

圖5 修飾電極對(duì)不同濃度葡萄糖的響應(yīng)Fig. 5 Response of Fe3O4-PGA@Au-GCE to different concentrations of glucose

選擇4 種常見(jiàn)糖類(lèi)作為干擾物質(zhì)評(píng)估無(wú)酶葡萄糖檢測(cè)生物傳感Fe3O4-PGA@Au-GCE器的檢測(cè)特異性。由圖6可知，濃度皆為0.1 mmol/L的乳糖、麥芽糖、果糖和蔗糖氧化峰的峰電流強(qiáng)度均在5 μA以下，與此同時(shí)，0.01 mmol/L的葡萄糖峰電流強(qiáng)度超過(guò)20 μA，說(shuō)明該生物傳感器具有選擇性檢測(cè)葡萄糖的性能。

圖6 Fe3O4-PGA@Au-GCE選擇性檢測(cè)葡萄糖Fig. 6 Selectivity of Fe3O4-PGA@Au-GCE toward glucose versus other tested sugar

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的Fe3O4-PGA@Au-GCE無(wú)酶型葡萄糖生傳感器在檢測(cè)純水中葡萄糖的過(guò)程中表現(xiàn)出了良好的性能，為拓寬其應(yīng)用范圍，需考察傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的相關(guān)表現(xiàn)。向不同種類(lèi)的純果汁中的添加不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再利用所制備的無(wú)酶?jìng)鞲衅鬟M(jìn)行測(cè)定，根據(jù)葡萄糖工作曲線獲得葡萄糖濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。在蘋(píng)果汁和柑橘汁中，無(wú)酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)實(shí)際樣品中葡萄糖回收率為99%～101%，且組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.3%，說(shuō)明此類(lèi)型無(wú)酶?jìng)鞲衅髟趯?shí)際樣品檢測(cè)中，具有良好精密度和重復(fù)性。

表1 實(shí)際樣品中葡萄糖含量的分析Table 1 Analytical results of glucose contents in real samples

3 結(jié) 論

本研究采用天然PGA綠色制備Fe3O4-PGA@Au，并利用金磁微粒優(yōu)良的模擬酶催化性能替代葡萄糖氧化酶構(gòu)建無(wú)酶型葡萄糖檢測(cè)生物傳感器。該粒子良好的分散性和催化活性，使修飾的電極檢在測(cè)葡萄糖的過(guò)程中呈現(xiàn)出較好的靈敏度和重復(fù)性。目前該粒子已被諸多研究成果證實(shí)具有多種天然酶的模擬酶性質(zhì)，可將其拓展于其他酶生物傳感器的構(gòu)建研究。此類(lèi)無(wú)酶型生物傳感器可以克服復(fù)雜的環(huán)境刺激，用于極限條件下各類(lèi)成分的分析，將為人體樣品、食品、藥品和環(huán)境組分檢測(cè)技術(shù)的改良提供基礎(chǔ)資料。