基于Fe3O4-PGA@Au 構建無酶電化學生物傳感器檢測葡萄糖

關樺楠，龔德狀，宋 巖，劉 博，韓博林，楊 帆，崔琳琳，張 娜

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

目前，用于葡萄糖檢測的電化學生物傳感器多依賴于其核心元件葡萄糖氧化酶的活性[1-3]。葡萄糖氧化酶為天然蛋白質酶，可特異性催化底物葡萄糖產生葡萄糖酸和過氧化氫。通過測定催化反應過程中電子遷移所產生的電信號構建葡萄糖檢測的電化學生物傳感器[1]。但是葡萄糖氧化酶成本較高，穩定性較差且固載技術復雜，使得此類型的生物傳感器應用時受到一定的限制[4]。

近年來，伴隨著納米模擬酶研究的發展，模擬酶已成為催化領域的研究熱點[5-8]。相比于天然酶，納米模擬酶具有成本低、穩定性高、可循環使用和催化活性強等諸多優點。在新興的葡萄糖氧化酶納米模擬酶中，金屬硫化物（MoS2）[9]、金屬氧化物（Co3O4、V2O5、CeO2和Mn3O4）[5]、碳納米材料（石墨烯、富勒烯和碳納米管）[7]、磁性粒子（Fe3O4）[10-12]和貴金屬粒子（Au、Ag和Pt）[12-14]吸引了諸多學者的關注；其中，磁性納米材料以其易回收和可循環利用的特點與具有良好催化活性的貴金屬納米材料相結合，已成為該領域的研究熱點[12-15]。

圖1 Fe3O4-PGA@Au 納米材料的制備過程（A）和電極修飾及檢測葡萄糖原理示意圖（B）Fig. 1 Schematic illustration of Fe3O4-PGA@Au nanocomposite fabrication process (A), electrode modi fication and electrooxidation of glucose (B)

本研究中，采用聚谷氨酸（poly-(γ-glutamic acid)，PGA）作為還原劑和交聯劑，一步法自組裝制備具有核殼結構的新型金磁微粒（Fe3O4-PGA@Au），具體過程如下：采用天然PGA綠色還原法制備Fe3O4-PGA微粒（圖1A-a），利用柑橘提取液綠色制備金納米粒子，并通過自組裝技術制備Fe3O4-PGA@Au納米粒子（圖1A-b）。PGA是一種水溶性多聚氨基酸，其結構為谷氨酸單元通過α-氨基和γ-羧基形成肽鍵的高分子聚合物，具有很強的生物相容性[16-18]。通過PGA的交聯作用，此粒子結合了磁性粒子和貴金屬納米粒子的優勢，具有良好的模擬酶催化活性、高穩定性和易回收的特點，可催化底物葡萄糖發生氧化還原反應。采用新型金磁微粒修飾玻碳電極，構建了葡萄糖檢測的無酶型電化學生物傳感器（圖1B-c），所獲得的傳感器針對葡萄糖表現出良好的電催化性能，在催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫的過程中形成明顯的電化學氧化峰（圖1B-d）。該類型無酶傳感器表現出良好的靈敏度，具有潛在的應用價值。本研究結果將為食品、藥品和環境成分檢測與分析技術的改良提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水氯化鐵、三水乙酸鈉、PEG-4000、葡萄糖天津市科密歐化學試劑有限公司；PGA、氯金酸 美國Sigma公司；葡萄糖檢測試劑盒 上海市德賽診斷系統有限公司；實驗中所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MAGNA-IR560E.S.P傅里葉變換紅外光譜儀 美國ULVCA-PHI公司；BT-9300H激光粒度分布儀 美國惠普公司；9600振動磁強計 美國LDJ Electronics公司；CHI660E電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；R-201旋轉蒸發儀 中國上海申順生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4-PGA@Au的制備與表征

金納米粒子的制備參考本課題組前期工作[19]，采用橘皮提取液快速合成。Fe3O4-PGA微粒采用一步綠色水熱還原法制備，具體流程如下：稱量0.8 g的FeCl3·6H2O粉末和0.1 g的PGA粉末，分散于60 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min；將整個體系移至水熱反應釜中，在180 ℃條件下反應6 h；將反應得到的黑色懸浮液分別用乙醇和去離子水清洗2 次，70 ℃條件下真空干燥5 h，獲得的黑色粉末即為Fe3O4-PGA。采用去離子水配制Fe3O4-PGA粒子懸浮溶液（100 mg/mL），向20 mL懸浮溶液中加入20 mL金納米粒子溶膠，渦旋振蕩2 min；用磁鐵在側壁吸附固定體系中的固體，棄去上清液，采用去離子水清洗固體2 次，冷凍干燥，即獲得Fe3O4-PGA@Au；4 ℃保存，備用。采用振動磁強計測定Fe3O4-PGA@Au的磁學性質，采用X射線衍射圖譜和傅里葉變換紅外光譜對合成的復合微粒結構進行分析。

1.3.2 無酶葡萄糖生物傳感器的構建

采用金相砂紙拋光玻碳電極（GCE，直徑3 mm），在去離子水中超聲清洗20 min，然后將電極置于強酸混合液（硝酸-鹽酸-水（1∶3∶4，V/V））中浸泡10 min，再在去離子水中超聲清洗20 min。將預處理后的玻碳電極浸置于Fe3O4-PGA@Au懸浮溶液（100 mg/mL）中，靜置2 min（恒電位為3.0 V），使玻碳電極表面吸附有帶有負電荷的金磁微粒，再用去離子水柔和清洗玻碳電極，用以去除游離的雜質；將吹干后的電極再次浸置于Fe3O4-PGA@Au懸浮溶液（100 mg/mL）中，靜置2 min，此為Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶型電化學生物傳感器，室溫靜置備用。

1.3.3 無酶生物傳感器檢測葡萄糖條件的優化

電化學測定在CHI660e型電化學工作站上進行，采用三電極體系：鉑電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，修飾的玻碳電極為工作電極。利用循環伏安（cyclic voltammetry，CV）法測定無酶生物傳感器檢測葡萄糖時氧化峰電流，通過峰電流強度評估并優化檢測體系的參數。分別考察檢測溫度、檢測時間、檢測pH值和掃描速率對檢測體系的影響。將1 mL葡萄糖標準液加入到15 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.2）中，將Fe3O4-PGA@Au-GCE浸入反應體系中，采用NaOH調節體系pH值為7.2～8.2，維持總體積16 mL，葡萄糖濃度為0.01 mmol/L，在不同水浴溫度條件下（30～55 ℃）孵育不同的時間間隔（5～30 min），設置不同的掃描速率（20～70 mV/s），根據結果篩選最佳檢測參數。

1.3.4 葡萄糖的檢測

使體系中葡萄糖濃度分別為0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0 μmol/L和100.0 μmol/L，采用Fe3O4-PGA@Au-GCE，根據優化后的體系參數，利用CV法檢測不同濃度葡萄糖的峰電流強度，觀察CV曲線變化。將峰電流強度換算為峰電流密度（即玻碳電極表面有效單位面積的電流強度（Id，μA/cm2），以峰電流密度為縱坐標、葡萄糖濃度（C，μmol/L）為橫坐標構建工作曲線，其中葡萄糖濃度分別設置為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00 μmol/L和1 000.00 μmol/L；選擇食品中常見的糖類作為參照（0.1 mmol/L，高于對照樣品中葡萄糖濃度10 倍），評估葡萄糖（0.01 mmol/L）檢測體系的抗干擾性能；測定葡萄糖0.01 mmol/L和0.1 mmol/L兩個標準溶液濃度，重復實驗5 次，采用所構建的工作曲線確定該體系的回收率和相對標準偏差。

1.3.5 實際樣品的檢測

選擇常見水果（紅富士蘋果和臍橙）作為實際樣品模型，并對樣品進行必要的前處理。將水果樣品分別去皮去籽后，充分粉碎攪拌至糊狀；再取該糊狀樣品1 g加入到20 mL錐形瓶中，并加入雙蒸水10 mL，超聲振蕩15 min后，離心去沉淀，將上清液用的微孔濾膜過濾（0.45 μm）一次；采用葡萄糖檢測試劑盒測定初始葡萄糖濃度；再向樣品上清液中添加不同濃度的葡萄糖標準液（0.1、0.5、1.0 mmol/L），采用Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶傳感器測定其電化學行為，重復實驗5 次。基于所構建的工作曲線計算實際樣品體系中的葡萄糖終濃度，考察檢測體系對實際樣品的加標回收率和相對標準偏差。

1.4 數據處理

利用Origin 8.0軟件處理數據并作圖，采用DPS 7.05軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Fe3O4-PGA@Au的表征

圖2 納米粒子的透射電子顯微鏡圖片Fig. 2 TEM images of Fe3O4-PGA nanoparticles (A and B), gold nanoparticles (AuNPs) (C) and Fe3O4-PGA@Au nanoparticles (D)

由圖2A、B可知，制備的Fe3O4-PGA粒子平均粒徑約為290 nm，呈現近似圓球形的顆粒；在黑色的Fe3O4核心外壁包覆有一層透明薄膜，厚度約為10 nm，初步判斷為PGA層。金納米粒子的透射電子顯微鏡圖見圖2C，金納米粒子粒徑約為4 nm，多由圓球型和圓棒型粒子組成。由圖2D可知，在Fe3O4-PGA粒子透明層表面吸附有大量的金納米粒子。Fe3O4-PGA@Au微粒的X射線衍射、傅里葉變換紅外光譜和磁學性質進行表征。

從圖3A可知，基于JCPDS 19-0629卡，衍射峰（111）和（311）對應Au；衍射峰（220）、（311）、（400）、（511）、（422）和（440）對應Fe3O4，說明Fe3O4-PGA@Au微粒中含有Au和Fe3O4。其中，（111）和（311）對應的衍射峰2θ為38.56°和77.58°[20-22]。Fe3O4衍射峰所對應的2θ為30.17°、35.54°、43.27°、53.62°、57.11°和62.85°，表明微粒中的Fe3O4為立方反尖晶石結構，具備良好的電磁性能[23]。

Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au的傅里葉變換紅外光譜圖譜見圖3B，Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au兩種微粒在578 cm-1處都出現Fe—O振動的吸收峰；同時，在1 610、1 659 cm-1和2 938 cm-1處都出現吸收峰，分別對應C＝C、C＝O和C—H鍵，這幾個化學鍵都來自于PGA的制備和修飾[16,24]。此外，Fe3O4-PGA在3 457 cm-1處具有明顯的吸收峰，對應氨基基團中的N—H，PGA作為一種天然的多聚氨基酸具有豐富的氨基基團[25]；而Fe3O4-PGA@Au中3 457 cm-1所對應的N—H峰強度變弱，說明金納米粒子已通過氨基與Fe3O4-PGA充分吸附[25]。Fe3O4-PGA和Fe3O4-PGA@Au的磁學性質分析結果表明，兩種納米粒子飽和磁化值分別為62.7 emu/g和42.3 emu/g，說明金納米粒子的吸附弱化了磁核的磁性。

圖3 Fe3O4-PGA@Au X射線衍射（A）和傅里葉紅外光譜（B）圖Fig. 3 X-ray diffraction pattern (A) and Fourier transform infrared spectrum (B) of Fe3O4-PGA@Au nanoparticles

2.2 Fe3O4-PGA@Au-GCE檢測體系的參數優化

由圖4A可知，峰電流強度隨掃描速率逐漸增大，當掃描速率超過50 mV/s后，峰電流強度逐漸下降，可能是較高的掃描速率時，修飾電極出現極化現象，形成暫態，影響了峰電流強度[26]。

從圖4B可知，檢測時間為15 min時，峰電流強度最高。此催化反應的產物中含有過氧化氫，其自身可以水解產生微弱電流；長時間催化所積累的過氧化氫會干擾電極對葡萄糖的識別性能，進而造成峰電流強度的下降。檢測葡萄糖的模擬酶的催化反應需要在弱堿環境中完成；且當體系中出現OH-時，葡萄糖分子易聚集于電極附近，降低葡萄糖氧化的活化能，使其更容易被氧化，因此設置pH值范圍為7.2～8.2[27]。從圖4C可見，當檢測體系的pH值為7.8時，峰電流強度最高；當pH值繼續升高，反應受到抑制，峰電流強度開始下降。從圖4D可知，最適反應溫度為40 ℃，當溫度繼續提升，峰電流強度開始下降，原因可能是溫度過高會造成電極表面金磁微粒的基底效應，引致修飾層的剝離，影響了峰電流強度[28]。綜上，選擇最佳檢測條件為掃描速率50 mV/s、檢測時間15 min、pH 7.8和反應溫度40 ℃。

圖4 掃描速率（A）、檢測時間（B）、體系pH值（C）和反應溫度（D）對Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶傳感器檢測葡萄糖的影響Fig. 4 Effect of scan rate (A), detection time (B), pH value (C) and reaction temperature (D) on detection of glucose using Fe3O4-PGA@Au-GCE non-enzymatic sensor

2.3 Fe3O4-PGA@Au-GCE檢測葡萄糖體系的構建

基于優化后的檢測體系，采用CV法評估葡萄糖無酶檢測體系的電化學響應性能，并構建葡萄糖檢測的工作曲線。由圖5可知，當體系中沒有葡萄糖時，CV曲線沒有出現明顯的氧化峰和還原峰；當體系中加入葡萄糖（0.1 μmol/L）時，在0.15 V處出現氧化峰，說明電極表面的金磁微粒可以替代葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖水解產生葡萄糖酸和過氧化氫，該過程形成電信號，出現氧化峰；當體系中葡萄糖的濃度逐漸增大，氧化峰的電流強度也逐漸提高[29-30]，葡萄糖濃度為100 μmol/L時，峰電流強度達到最大值-27.3 μA。由圖5可知，葡萄糖濃度C與峰電流密度Id在兩段濃度范圍內存在良好的線性關系，與其他的研究類似[12,29]。在葡萄糖濃度范圍為0.1～5.0 μmol/L時，峰電流密度回歸方程為Id=2.95C+57.37，R2=0.978 5；在10～250 μmol/L時，峰電流密度回歸方程為Id=0.118 9C+81.61，R2=0.984 5，檢出限為0.74 μmol/L（RSN=3）。結果表明，回收率在96%～107%之間，相對標準偏差在3%～5%之間，符合檢測要求（12%以下）[30]。采用Fe3O4-PGA@Au-GCE所構建的無酶葡萄糖檢測傳感器具有較高的靈敏度和重復性。

圖5 修飾電極對不同濃度葡萄糖的響應Fig. 5 Response of Fe3O4-PGA@Au-GCE to different concentrations of glucose

選擇4 種常見糖類作為干擾物質評估無酶葡萄糖檢測生物傳感Fe3O4-PGA@Au-GCE器的檢測特異性。由圖6可知，濃度皆為0.1 mmol/L的乳糖、麥芽糖、果糖和蔗糖氧化峰的峰電流強度均在5 μA以下，與此同時，0.01 mmol/L的葡萄糖峰電流強度超過20 μA，說明該生物傳感器具有選擇性檢測葡萄糖的性能。

圖6 Fe3O4-PGA@Au-GCE選擇性檢測葡萄糖Fig. 6 Selectivity of Fe3O4-PGA@Au-GCE toward glucose versus other tested sugar

2.4 實際樣品的檢測結果

本實驗所構建的Fe3O4-PGA@Au-GCE無酶型葡萄糖生傳感器在檢測純水中葡萄糖的過程中表現出了良好的性能，為拓寬其應用范圍，需考察傳感器在實際樣品檢測中的相關表現。向不同種類的純果汁中的添加不同濃度的葡萄糖標準液，再利用所制備的無酶傳感器進行測定，根據葡萄糖工作曲線獲得葡萄糖濃度，結果見表1。在蘋果汁和柑橘汁中，無酶傳感器檢測實際樣品中葡萄糖回收率為99%～101%，且組內相對標準偏差為7.3%，說明此類型無酶傳感器在實際樣品檢測中，具有良好精密度和重復性。

表1 實際樣品中葡萄糖含量的分析Table 1 Analytical results of glucose contents in real samples

3 結 論

本研究采用天然PGA綠色制備Fe3O4-PGA@Au，并利用金磁微粒優良的模擬酶催化性能替代葡萄糖氧化酶構建無酶型葡萄糖檢測生物傳感器。該粒子良好的分散性和催化活性，使修飾的電極檢在測葡萄糖的過程中呈現出較好的靈敏度和重復性。目前該粒子已被諸多研究成果證實具有多種天然酶的模擬酶性質，可將其拓展于其他酶生物傳感器的構建研究。此類無酶型生物傳感器可以克服復雜的環境刺激，用于極限條件下各類成分的分析，將為人體樣品、食品、藥品和環境組分檢測技術的改良提供基礎資料。