黃曲霉毒素B1降解菌的篩選與鑒定

劉寶臣 齊闖 孫英旗

摘要：

黃曲霉毒素B1主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，其具有極高的致突變性、毒性和致癌性。黃曲霉毒素污染廣泛存在于奶制品、飼料等行業(yè)中。本研究以香豆素為碳源，篩選出1株降解率為8277%的黃曲霉毒素B1降解菌，經(jīng)生理生化試驗初步鑒定屬于芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：

黃曲霉毒素B1;降解菌;篩選;鑒定

中圖分類號：S-3

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：1019754/jnyyjs20200630006

黃曲霉毒素（Aflatoxin）主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，其具有極高的致突變性、毒性和致癌性[1]。在所有黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強。AFB1具有二呋喃香豆素衍生物一組相關(guān)結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)與香豆素十分相似。

黃曲霉毒素污染廣泛存在于奶制品、飼料等行業(yè)中，玉米飼料原料中的AFB1不僅影響牲畜健康[2]，還會在奶牛體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)锳FM1，從而污染奶制品。2011年12月24日，國家質(zhì)檢總局抽查發(fā)現(xiàn)蒙牛乳業(yè)（眉山）的盒裝鮮奶黃曲霉毒素M1超標(biāo)達140%[3]。目前去除AFB1的物理方法包括烘烤、吸附劑、紫外線照射、電離輻射等，化學(xué)方法主要有堿法、氧化法等[4]。但這些方法存在營養(yǎng)損失、質(zhì)量下降、設(shè)備成本高等缺點，限制了其實際應(yīng)用效果。利用微生物或其代謝物將AFB1降解和解毒，具有諸多優(yōu)點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有幾種微生物能夠?qū)FB1轉(zhuǎn)化為毒性較小的代謝物，如平菇、花葉菌、根霉、毛霉、釀酒酵母、木霉、乳酸桿菌、丙酸桿菌[5，6]，但尚無實際應(yīng)用報道。

本研究以香豆素為唯一碳源對AFB1降解菌進行初篩，復(fù)篩使用HPLC法測定降解菌的AFB1降解率，并進行初步的生理生化鑒定，以期為今后AFB1的降解研究及其在飼料業(yè)與奶制品業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料

111土壤樣品

土壤樣品取自吉林市猴石山與吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院。

112培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：NaCl05%、蛋白胨1%、牛肉膏03%，pH70。

初篩培養(yǎng)基：KH2PO40025%、香豆素05%、CaCl201%、NH4NO301%、FeSO401%、MgSO40025%、瓊脂15%，pH70。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%、牛肉膏03%、葡萄糖02%、KH2PO401%、NaCl0085%，pH70。

NB培養(yǎng)基：蛋白胨1%、酵母膏5%、NaCl1%、瓊脂2%、水1000mL，pH70。

113試劑

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、龍膽紫、氯霉素、香豆素等為國產(chǎn)分析純;AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma生產(chǎn);生理生化鑒定試劑盒，青島海博生物生產(chǎn)。

12儀器與設(shè)備

YM50AI全自動滅菌鍋（諸誠市中耀機械有限公司）;SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司）;恒溫培養(yǎng)箱Termaks series KB8000（常州首創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司）;SC-15A恒溫水浴鍋（杰瑞安儀器設(shè)備有限公司）。

13實驗方法

131降解菌初篩

稱量1g土樣，置于50mL生理鹽水中，160r/min、30℃下，搖床培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后靜置20min，吸取1mL上清液用無菌蒸餾水稀釋置10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。稀釋后的樣品吸取03mL均勻涂布于初篩培養(yǎng)基上，在37℃中培養(yǎng)3～7d后，挑取單菌落于NB培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)。

132降解菌復(fù)篩

初篩得到的菌株在NB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)1d。以5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃下，培養(yǎng)2d。取980μL發(fā)酵液和20μLAFB1標(biāo)準(zhǔn)品（100g/mL）混勻，20μLAFB1標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品為空白對照，同時設(shè)置2組平行實驗，37℃，150r/min培養(yǎng)3d后，12000r/min，5min離心，取上清液待測。

133HPLC檢測AFB1降解率

AFB1的提取和含量檢測方法參照GB 500922—2016。渦流振蕩30s，共3次。移取二氯甲烷層，在36℃氮吹儀下干燥后，溶于1mL的乙腈，使用022μm微孔濾膜過濾。

色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（150mm×46mm，5μm）;流動相為甲醇∶水=1∶1（V∶V），流速09mL/min;柱溫30℃，運行時間30min，檢測波長為365nm。AFB1的降解率用以下公式進行計算。

AFB1降解率（%）=（1-實驗組AFB1含量/對照組AFB1含量）×100%

134形態(tài)學(xué)鑒定

肉眼觀察菌落形態(tài)并使用革蘭氏染色法[7]進行鑒定。

135生理生化鑒定

使用生理生化鑒定試劑盒分別進行V-P測定試驗、明膠液化試驗、O/F試驗、硝酸鹽還原實驗、檸檬酸鹽利用試驗、甲基紅試驗、硫化氫試驗與糖酵解試驗[8]。

2結(jié)果與分析

21菌種的初篩結(jié)果

將香豆素作為唯一碳源的培養(yǎng)基，通過初步篩選，得到10株能夠穩(wěn)定降解的菌株。對采集得到的不同土樣分析得知，其中6株來自于猴石山采取的土樣，4株來自于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園里采取的土樣。

22菌種的復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的10株菌株進行復(fù)篩，進行降解率測定。如表1所示，有3株降解菌（LQ-HT1、LQ-HT3、LQ-HT4）的降解率達到70%以上，其中1株降解菌（LQ-HT3）的降解率最高為8277%，分析菌種的來源可知，野生環(huán)境下的土壤更容易篩選得到降解率較高的菌株。

23AFB1降解菌株的鑒定

菌落形態(tài)如圖1所示，該降解菌在LB培養(yǎng)基上的形態(tài)呈圓形、潮濕，具有粘性，帶有光澤;如圖2所示，細(xì)胞形態(tài)為桿狀，有芽孢，革蘭氏陽性菌。

24AFB1降解菌的生理生化鑒定

生理生化鑒定試驗結(jié)果表明，細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果為陽性菌，可以利用檸檬酸和丙酸，符合大多數(shù)芽孢桿菌的特征[9]，結(jié)合其它生理生化指標(biāo)（表2），判斷LQ-HT3屬于芽孢桿菌屬。

3結(jié)論

本研究篩選得到1株可降解AFB1的菌株LQ-HT3，降解率為8277%。形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定試驗結(jié)果表明其屬于芽孢桿菌屬。應(yīng)用本研究成果，可以對AFB1降解菌進行分子生物學(xué)鑒定，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高其AFB1降解能力，以期早日應(yīng)用于奶制品與飼料行業(yè)中。

參考文獻

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[9]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

（責(zé)任編輯李媛媛）