利福平誘導小鼠肝臟炎性損傷中相關因子的動態變化

張咪　吳冬雪　王雪　朱晗瑀　楊璐銘　王林　裴盛斐　馮福民

摘要 目的 初步探討利福平誘導小鼠肝損傷過程中，炎癥因子及相關指標的變化情況。方法 48只昆明小鼠隨機分為基線組和利福平組，灌胃3、5、7、10、15天后處死。酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量。RT-PCR和ELISA法檢測肝組織中核因子κB（NF-κB）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的mRNA及蛋白表達水平。結果 肝組織病理學及MDA、SOD水平變化，提示肝臟損傷進展。與基線組相比，利福平組NF-κB或TNF-α的mRNA及蛋白表達水平均在第7天和第10天出現顯著升高（P<0.05）。結論 利福平可能通過激活NF-κB信號通路誘導小鼠肝臟發生炎性損傷。

關鍵詞 抗結核藥物;肝損傷;NF-κB;小鼠

中圖分類號? R575? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2020）10-030-03

DYNAMIC CHANGES OF RELATED FACTORS IN RIFAMPICIN-INDUCED LIVER INFLAMMATORY INJURY IN MICE Zhang Mi，Wu Dongxue，Wang Xue，et al. School of Public Health， North China University of Science and Technology， Tangshan 063210， China

Abstract? Objective To explore the changes of NF-κB and TNF-α in liver injury induced by rifampicin in mice.Methods Forty-eight Kunming mice were randomly divided into the baseline group and the rifampicin group， and were sacrificed after gavage for 3d， 5d， 7d， 10d and 15d.The levels of MDA and SOD in serum were detected by ELISA.RT-PCR and ELISA were used to detect mRNA and protein expression levels of NF-κB and TNF-α in liver tissues.Results Changes in liver histopathology and MDA and SOD levels suggested the progression of liver injury.Compared with the baseline group，the mRNA and protein expression levels of NF-κB or TNF-α in the rifampicin group were significantly increased on the 7th and 10th days（P<0.05）. Conclusion Rifampicin may activate the NF-κB pathway during liver injury in mice.

Key words? Antituberculosis drugs; Liver injury; NF-κB; Mice

據中國疾病預防控制中心統計，2017年我國肺結核發病數為835193人，死亡人數為2831人。近年來，結核發病率在我國乃至全球范圍內呈現急劇增加的趨勢，死亡率居各傳染病之首[1]。結核病患者在接受抗結核藥物治療時可出現多種不良反應，極易出現抗結核藥物性肝損傷（Antituberculosis liver injury，ADLI）[2]。其中，利福平是利福霉素類半合成抗生素，在治療結核疾病方面具有廉價、高效的優點，并且與異煙肼等其他抗結核一線藥物相比，具有特殊的藥物作用途徑。雖然ADLI是多因子介導的疾病，其發生機制尚不明確。但有研究發現，氧化應激可顯著影響ADLI的發生[3]。抗結核治療期間會產生大量可與肝酶或膜受體結合致細胞代謝和功能紊亂的活性氧（ROS）[4]。核因子-κB（NF-κB）是被證實可由ROS激活的真核細胞轉錄因子，ROS和NF-κB通過相互激活表現出正反饋效應[5-7]。也有研究表明，在乙醇引起的肝損傷中，肝細胞內NF-κB活性顯著增加，與肝損傷程度呈高度正相關[8]。但NF-κB與利福平所致肝損傷之間的關系仍需要進一步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及處理[9]

在中國阜康生物技術有限公司購買48只SPF級昆明小鼠[動物許可證號：SCXK（北京）2009-0004]，雌雄各半。分別于灌胃給予藥物利福平前一天及給藥后3、5、7、10、15天各隨機處死8只，劑量按照臨床成人正常用藥劑量的9倍計算所得，135mg/Kg.d。隨后進行病理學及血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平和肝組織中NF-κB和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的mRNA以及蛋白含量檢測。實驗獲得了動物倫理委員會的批準（批準號：14-016）。

1.2 檢測指標

1.2.1 組織病理學改變[9]

取小鼠肝組織，福爾馬林固定，脫水包埋、切片、染色。鏡下觀察染色結果。

1.2.2 檢測小鼠血清MDA、SOD水平

酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（購于南京建成生物工程研究所）檢測血清MDA、SOD水平。

1.2.3 檢測肝組織中NF-κB和TNF-α的mRNA表達水平。

TRIzol法提取總核糖核酸（RNA），逆轉錄和RT-PCR使用試劑盒（購于Invitrogen公司），RT-PCR條件為94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 30s，35個循環。

1.2.4 檢測肝組織中NF-κB和TNF-α蛋白含量

肝組織和鹽水按照1∶4制成勻漿，離心并收集上清液。ELISA試劑盒檢測基線組和利福平組小鼠肝組織中NF-κB和TNF-α蛋白含量。

1.3 統計學分析

采用SPSS23.0軟件系統分析數據，計量資料以“均數±標準差”的形式表示，組間均數比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝組織病理改變

基線組肝細胞無明顯形態變化（圖1-D）。利福平組給藥后3天開始表現出明顯的形態學變化，肝細胞腫脹，炎性細胞增多，胞質空泡化，核皺縮，到15天損傷程度最為嚴重（圖1-R3d～R15d）。

2.2 小鼠血清MDA、SOD水平

利福平給藥后第5天MDA和SOD指標出現變化，其中MDA隨著給藥時間的延長，呈上升趨勢，而SOD呈下降趨勢，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 小鼠肝組織NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白表達

利福平給藥后小鼠肝組織NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白表達呈現先升高后略降低趨勢，均以給藥后的第7天最高，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），見圖3。

3 討論

NF-κB作為重要的炎癥因子，在靜息狀態下，細胞胞質中NF-κB因與IκB結合而處于非活性狀態[10-11]。當細胞受到氧化應激刺激時，氧化應激可導致IκB降解并與NF-κB分離[12]。活化的NF-κB易位入核與炎癥介質靶基因啟動子區域的κB位點結合，導致炎癥介質基因的過表達[13-14]。在本研究中，與基線組比較NF-κB的基因表達水平隨著用藥時間的延長發生了顯著的變化，提示NF-κB通路被激活。TNF-a作為腫瘤壞死因子，在炎癥發生時，變化是最顯著的，又因為TNF-a是NF-KB的下游炎癥因子，因此，本研究也對TNF-a進行了動態監測，進一步測量了TNF-α的mRNA及蛋白表達，發現NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白的表達趨勢一致。這些結果說明，在抗結核藥物利福平誘導的小鼠肝臟損傷過程中，可能由NF-κB通路及下游炎癥因子TNF-α共同介導，但具體機制尚不清楚。此外，我們發現利福平組中NF-κB的表達水平先升高后略有下降。前期研究發現用利福平處理的人單核細胞和小鼠均可抑制NF-κB的活化[15-16]，可能原因是利福平到達一定濃度可抑制NF-κB活化并減少促炎因子的產生。另外，SOD、MDA不僅代表了肝臟損傷進展，也是氧化應激的指標，但是否是氧化應激作用導致NF-κB和TNF-α的mRNA及蛋白水平變化，兩者之間的因果聯系有待進一步研究。

總之，本研究結果表明，NF-κB通路在利福平誘導的小鼠肝臟損傷過程中被激活，但具體機制尚未明確，本課題組將繼續在體內、體外研究深入探討抗結核藥物造成的肝臟炎性損傷，以期為抗結核藥物性肝損傷的預防和保肝治療提供實驗基礎。

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[2020-01-15收稿]

作者單位：063210 河北省唐山市，華北理工大學公共衛生學院（張咪、吳冬雪、王雪、朱晗瑀、楊璐銘、王林、裴盛斐、馮福民）;生命科學學院（馮福民）

*通訊作者