殼聚糖與殼寡糖抑菌保鮮研究進展

楊煥蝶 張翔 亞歷山大·蘇沃洛夫 陳蕾蕾 趙雙枝 王軍華 王維婷 楊金玉

摘要：果蔬采后呼吸作用旺盛，表面微生物代謝活躍，內部水分容易蒸發，品質極易在運輸及儲藏過程中下降。殼聚糖與殼寡糖具有廣譜的抑菌效應及良好的生物相容性，相比于傳統的合成保鮮劑，具有無毒、高效、低殘留的優勢，現已廣泛應用于采后果蔬的保鮮處理。本研究著重對殼聚糖與殼寡糖的生物活性、制備方法、抑菌機制及其在果蔬保鮮應用等方面的最新成果進行綜述，并提出了未來兩種物質在果蔬保鮮應用上的主要發展方向。

關鍵詞：殼聚糖;殼寡糖;制備;抑菌機制;保鮮

中圖分類號：S379 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0167-06

Abstract Quality of postharvest fruits and vegetables are easy to be seriously degraded during transportation and storage due to vigorous respiration， active metabolism of surface microorganisms and evaporation of internal moisture. Chitosan and chitooligosaccharide have broad-spectrum antimicrobial effects and good biocompatibility. Compared with traditional synthetic preservatives， chitosan and chitooligosaccharides are non-toxic， efficient and low residual. Therefore they have been widely used in fresh-keeping post-harvest fruits and vegetables. This paper focused on the latest research progresses of chitosan and chitooligosaccharide in biological activity， preparation method， antimicrobial mechanism and preservation of postharvest fruits and vegetables. The main research directions of chitosan and chitooligosaccharides for preservation of postharvest fruits and vegetables in the future were put forward.

Keywords Chitosan; Chitooligosaccharides; Preparation; Antimicrobial mechanism; Preservation

殼聚糖及其衍生物資源豐富，制備方法簡單，具有多種生物活性。殼寡糖是殼聚糖經物理化學或者生物酶法制備的降解產物。殼聚糖和殼寡糖均具有低殘留、無毒等特性，利用它們的抑菌活性及成膜性對果蔬進行保鮮處理，能夠有效延長果蔬貨架期，是近年來新興的一種綠色保鮮技術。本研究對殼聚糖和殼寡糖的生物活性、制備方法、抑菌機制及其在果蔬保鮮應用等方面進行綜述，旨在為了解殼聚糖和殼寡糖的制備方法和果蔬采后保鮮應用提供參考。

1 殼聚糖、殼寡糖生物活性及功能

1.1 殼聚糖

甲殼素（幾丁質）多存在于甲殼類動物如蝦、蟹及真菌類中，結構同纖維素一樣高度有序，產量僅次于纖維素，是目前僅有的堿性多糖[1-4]。殼聚糖（chitosan， CS）是甲殼素經脫乙酰作用獲得的產物，脫乙酰度為40%～98%，分子量范圍為5×104～2×106 Da[5]。其結構為殼二糖組成的復雜雙螺旋結構，富含2-乙酰氨基葡萄糖胺和2-氨基葡萄糖[6]。Sajomsang等[7]研究發現脫乙酰化的程度直接影響殼聚糖中游離氨基和羥基的比例，分子中活潑的氨基和羥基賦予其優于幾丁質的溶解性、生物相容性、生物降解性、成膜性及其它化學反應活性。但是，Zhang等[8]認為殼聚糖的生物活性及功能是由乙酰化程度與分子量共同決定的，并因其在采后果蔬保藏方面表現出高效、低殘留、對非目標物低毒或無毒的特點，現已受到廣泛關注。

1.2 殼寡糖的生物活性及功能

殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）是由N-乙酰基-葡糖胺（A-單元）和D-葡糖胺（D-單元）兩種結構單元組成的線性低聚物[9，10]，即殼聚糖經降解后聚合度在2～20、平均分子量低于3 900 Da的產物。其理化性質及生物活性優于殼聚糖，具有更高的溶解度、生物相容性、生物降解能力、抑菌活性、抗氧化能力等特性，以及更低的粘度。研究發現，殼寡糖具有更廣泛的生物應用范圍：在醫學方面，Yang等[11]表明殼寡糖可通過調節脂質的轉移來降低膽固醇;在農業方面，殼寡糖與ε-聚-L-賴氨酸聯合使用能夠代替合成殺菌劑，具有明顯的抗植物病原菌Botritis cinerea的活性[12];此外，Zong等[13]在食用油菜葉片上噴施殼寡糖，發現它通過促進油菜葉片抗氧化酶活性和改變鎘的分布，明顯改善了鎘脅迫引起的作物產量和質量的下降;在食品工業方面，殼寡糖的成膜性可被用作食品保鮮薄膜[14]。

2 殼聚糖和殼寡糖的制備方法

制備殼聚糖及殼寡糖的方法多種多樣，不同方法制備的兩種多糖的物理化學性質以及生物活性各不相同。經過長時間探索，較常用的是化學法、酶法和物理法。用40%KOH溶液在90℃條件下處理蝦殼6 h，可獲得脫乙酰度達78%、平均分子量為6 273 Da的殼聚糖[15]。在pH值6.0、溫度60℃條件下，用濃乙酸鈉洗滌蘇云金芽孢桿菌能夠獲得殼聚糖分解活性，55 h內可將600～800 kDa、脫乙酰度（DD）≥ 90%的10 g/L殼聚糖溶液完全轉化為寡糖，大部分聚合度在2～5之間[16]。用電子束等離子體處理蟹殼幾丁質和殼聚糖固體粉末，可得到Mw為 800～2 000 Da、聚合度在1.5～2.5的殼寡糖，產率達95%，該多糖可抑制各種酵母和絲狀真菌的生長，最低抑制濃度為0.5 mg/mL[17]。

相較于化學物理制備法，用酶來制備殼聚糖及殼寡糖的反應條件較溫和。由于使用的化學試劑少，對環境的污染小，越來越多的科研工作者更青睞使用酶法來制備兩種多糖。Zhang等[18]利用幾丁質酶水解未經預處理的家蠅幼蟲粉，所得產物殼寡糖的聚合度在2～6之間，表現出最強的抗菌活性，孵育3 d最大產量為158.3 μg/mL;Xie等[19]用纖維素酶將80%脫乙酰度的殼聚糖分解，得到聚合度在3～11的殼寡糖，進一步研究得到聚合度為6～11的殼寡糖，得率高達55%;Lü等[20]將乳酸乳球菌的重組幾丁質酶通過大腸桿菌過表達，用該酶水解工業生產中廢棄的真菌菌絲體中的甲殼素，產物殼寡糖純度可達70%，結合使用蝸牛酶時，產量和產物純度增大。

為了獲得更高的制備效率和生物活性，常把幾種制備方法結合使用，如化學-酶法、物理-酶法、物理-化學法等。將魷魚骨進行物理法即壓縮-膨化預處理后進一步提取殼聚糖，相較傳統的熱化學強堿提取法更環保，提取的低聚糖提取率與抗菌活性更高[21]。Sánchez等[22]認為先通過化學降解再酶解，可獲取63%全脫乙酰的寡糖序列，可有效抑制大腸桿菌和李斯特菌，而單純通過殼聚糖酶解的產物只含有27%全脫乙酰的寡糖序列，僅存較少比例的游離氨基序列以及乙酰基團能增強殼寡糖分子的抗菌效力。

3 殼聚糖及殼寡糖抑菌活性

不同分子量、脫乙酰度的殼聚糖和殼寡糖對病原細菌與病原真菌的抑制程度具有很大差異，pH值的變化對其抑菌效應也存在較大影響。高分子量的殼聚糖不能進入微生物體內，僅附著在細胞表面，但在低pH值時可與細胞膜上負電荷相互作用引起膜裂解，使其釋放內容物，導致微生物死亡，還可以阻斷營養物質的運輸或者螯合部分對微生物生長有益的金屬離子影響微生物生長，也可使正常進行有氧呼吸的細胞因缺氧而抑制生長。較低分子量的殼聚糖及殼寡糖能夠進入細胞作用于DNA，抑制mRNA與蛋白質的合成，引起細胞生理生化指標的改變，而其脫乙酰化水平越高含的游離氨基數目越多，與細胞膜的作用越強。較低的乙酰度和pH值更利于殼聚糖發揮其抑菌活性，殼聚糖分子量的降低能增強對革蘭氏陰性菌的抑制性，而對革蘭氏陽性菌的抑制關系正相反;對真菌抑制試驗表明殼聚糖抑菌效應取決于被抑制菌的種類，與其特性相關不大，例如提高殼聚糖的分子量能夠抑制尖孢鐮刀菌正常生長，降低殼聚糖的乙酰度能抑制鏈格孢菌生長[23]。因此，殼聚糖與殼寡糖的抑菌效應不只取決于其相對分子質量、乙酰化水平，還取決于所作用的微生物種屬。研究表明，殼聚糖與殼聚糖的分子量對念珠菌屬生物膜的抗真菌活性之間沒有相關性，兩種多糖通過影響微生物生物膜的形成來影響微生物的生長發育，在殼聚糖的作用下，念珠菌屬的生物量和代謝活動在粘附和成熟階段分別減少約70%、80%[24]。

為了增強殼聚糖以及殼寡糖的抗菌活性與抑菌廣譜性，多對它們進行化學改性進而研究其復合物的生物活性。ε-聚賴氨酸-殼聚糖綴合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有抑制活性，綴合物的抗菌活性高于單一的殼聚糖。聚賴氨酸和殼聚糖的質量比是影響抗菌效應的關鍵因素，ε-聚賴氨酸的比例越大，抗菌活性越強，二者比例為1∶ 1時表現出最強的抗菌活性，對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制區的直徑約為9.19 mm[25]。Tan等[26]研究發現，含1，2，3-三唑鎓和吡啶鎓基團的殼聚糖衍生物溶解度增高、抗真菌效率提高，并在濃度為1.0 mg/mL時對炭疽病菌抑制指數達98%以上。季銨化殼聚糖衍生物對灰霉病菌和炭疽病菌顯示出強烈的抑制作用，在濃度為1.0 mg/mL時抑制效率（>90%）最高，而其抑制效率同樣受分子量的影響，高分子量的季銨化殼聚糖衍生物顯示出更強的抗真菌活性[27，28]。

4 殼聚糖與殼寡糖抑菌機理

研究人員已對殼聚糖與殼寡糖對微生物的抑制機理做出假說并進行試驗驗證，包括對被作用微生物結構組成、關鍵酶活性、基因表達等生理生化指標變化的測定。目前普遍認可的抑菌機理有以下四種：

第一，抗菌活性來自其氨基（NH2）的正電荷（NH+3）。當pH ? ? 第二，殼聚糖分子降解產物可以通過多層交聯的胞壁到達細胞內部，作用于微生物的DNA，抑制mRNA和蛋白質合成，從而導致關鍵酶活性及基因表達的變化，影響微生物生長[30，34-36]。閆佳琪等[37]研究殼聚糖涂層加二氧化氯對酶活性影響發現，苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性均受到明顯抑制。

第三，殼聚糖可以螯合金屬離子。當pH>pKa（6.3）時，殼聚糖具有優異的金屬陽離子吸收螯合能力，能夠與含有陰離子的細菌膜相互作用，改變細菌表面形態、增加膜滲透性、導致細胞內物質泄漏，還可以降低膜滲透性、防止營養運輸，或者形成不透氣涂層、抑制微生物生長[5，29，31，38，39]。

第四，殼聚糖的聚合成膜特性使其能夠在細胞表面形成一層薄膜。該膜在阻止營養物質進入細胞的同時還可阻止氧氣進入，從而抑制好氧微生物生長[40，41]。

5 殼聚糖-殼寡糖果蔬采后保鮮作用

人體食用新鮮果蔬可補充維生素、礦物質和膳食纖維等營養物質，但是果蔬采后不易儲藏或儲藏時間短，易出現因水分流失、呼吸作用劇烈、病原微生物侵染以及衰老相關基因表達等引起的失水皺縮、腐爛變質等現象。殼聚糖與殼寡糖是天然無毒的生物保鮮劑，具有成膜性和廣譜抑菌活性，能在果蔬表面形成具有選擇性透過膜的同時抑制果蔬呼吸速率和病原微生物生長。Devlieghere等[40]發現殼聚糖涂層加28 mg/L二氧化氯可明顯抑制冷藏期間鮮切竹筍微生物（總需氧菌、酵母菌、霉菌）生長，也可保持竹筍較高品質，延緩褐變和木質化進程，顯著抑制苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脫氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性，調節竹筍代謝活動。Xing等[42]認為殼聚糖與殼寡糖能夠誘導果蔬產生抗微生物信號分子，這些信號分子通過改變與抗病相關的次生代謝物含量來提高果蔬對病害的抵抗能力，或者誘導果蔬產生保護自身抗性。Sun等[12]研究發現，ε-聚賴氨酸與殼寡糖組合能夠誘導采后番茄水楊酸、苯丙氨酸和茉莉酸水平增加，提高氨裂解酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，降低過氧化氫酶活性和脫落酸、赤霉素水平，從而增加采后番茄貨架期。

目前，因殼聚糖與殼寡糖對非目標物無毒，已被廣泛應用于多種果蔬：甘薯、綠蘆筍、番茄、鱷梨、草莓等[12， 35， 37， 42，43]的保鮮過程中（表1）。相關應用研究表明，使用2 mg/mL殼聚糖處理甘薯塊根，對甘薯黑斑病菌抑制率可達87.02%，并能夠完全抑制病原菌孢子萌發甚至致其死亡[42];閆佳琪等[37]用1.5%（w/v）的殼聚糖溶液處理采后鱷梨發現，處理后的果實基因表達變化明顯，7 d保質期內的果實硬度較高，質地、肉色、味道等的接受度較高;Qiu等[43]發現高分子量與低分子量的殼聚糖在濃度為4 mg/mL時可有效抑制采后綠蘆筍中分離得到的鐮刀菌生長，濃度為0.05 mg/mL時完全抑制鐮刀菌孢子萌發，并且對非目標物無毒，可使綠蘆筍在28 d的冷藏期間保持良好品質;Gao等[46]使用肉桂醛-殼聚糖涂層可明顯延緩采后臍橙質量下降速度;Duran等[45]將殼聚糖復合抗菌劑如乳酸鏈球菌肽、游霉素、石榴和葡萄籽提取物應用于新鮮草莓保鮮，果實質量改善明顯并延長30 d的保質期;Perdones等[47]用1%高分子量殼聚糖和3%檸檬油制成的復合涂料可以減緩草莓呼吸速率并能夠有效抑制番茄灰霉病菌，對采后新鮮草莓保質期的延長效果顯著;200 mg/L ε-PL與400 mg/L COS組合具有最佳的體外抗真菌活性和誘導抗性，對番茄灰霉病菌的抑制率高達90.22%[12]。

6 展望

殼聚糖-殼寡糖在理化性質、生物活性等方面存在限制因素，致使其在果蔬保鮮方面的應用受到諸多限制[49]。但曹麗娟等[50]研發的殼聚糖抑菌可食用保鮮膜大大提高了抑菌效果，增強了殼聚糖及其衍生物的抑菌效應，一定程度上擴大了抑菌廣譜性，為殼聚糖-殼寡糖的應用開辟了新途徑。因此，本研究建議加強殼聚糖等多種多糖與金屬離子、多聚鹽、抗菌劑、精油等相結合的復合新型保鮮膜的研發，從而更好地為滿足農產品保鮮對綠色、經濟、實用保鮮技術的需求提供保障。

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