劍葉龍血樹內生放線菌活性菌株的篩選和鑒定

田守征 黃之鐠 趙玉瑛 趙慶 張曉梅

摘 要：? 為篩選具有抗菌抗腫瘤活性的藥用植物內生菌資源，該文對300余株分離自中國云南西雙版納及越南地區劍葉龍血樹的內生放線菌采用瓊脂塊擴散法進行抗病原細菌活性篩選、平板對峙法進行抗真菌活性篩選、SRB法測定菌株的細胞毒活性及PCR擴增方法篩選非核糖體肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因;對得到的優勢菌株經8種培養基進行發酵，采用10種病原細菌、3種病原真菌及2種人腫瘤細胞株測試其發酵粗提物的抗菌及抗腫瘤活性以確定最佳發酵培養基;用16S rRNA基因測序方法初步鑒定5株優勢菌株的分類地位。結果表明：初篩得到5株抗菌活性、體外細胞毒活性及NRPS、PKS相關基因表達陽性的菌株S01-S05，其中4株（S01-S04）屬于鏈霉菌屬、1株（S05）屬于類諾卡氏菌屬;菌株經不同培養基發酵后產物的抗菌和抗腫瘤活性不同，其中Streptomyces sp. S04在7種培養基中的發酵提取物對8種測試病原菌均有較強抑制作用，且該菌株用Medium C的發酵提取物對人肝癌 Hep G2 細胞株抑制率達到 100%，為劍葉龍血樹內生菌活性成分挖掘及新型抗菌藥物篩選奠定了基礎。

關鍵詞： 劍葉龍血樹， 內生放線菌， 抗菌活性， 抗腫瘤活性， 16S rRNA基因分析

中圖分類號：? Q939

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）05-0727-08

Bioactivity and identification of endophytic actinomycetes from Dracaena cochinchinensis

TIAN Shouzheng1， HUANG Zhipu2， ZHAO Yuying2，

ZHAO Qing2， ZHANG Xiaomei1*

（ 1. College of Basic Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

Abstract：? In order to screen endophytic bacteria resources with antitumor activities from medicinal plant， 300 endophytic actinomycetes isolated from Dracaena cochinchinensis collected from Xishuangbanna， China and Vietnam were studied. SRB method was used to detect the activity of antitumor cells， agar diffusion and plate confrontation methods were used to test antimicrobial activities， Polymerase Chain Reaction was used to detect NRPS， PKS-I and PKS-Ⅱ genes， and the taxonomic studies of the five selected active strains were performed using 16S rRNA gene analysis. Eight media were designed to cultivate five selected active strains and the antimicrobial activities of their fermented extraction were detected by oxford-cup test against ten pathogenic bacteria and three pathogenic fungi， the antitumor activities were measured by MTT assay in two tumor cell lines. As a result， four of the five active strains were classified as Streptomyces spp. and the remaining one as Nocardioides sp. Different media resulted in different activities， most media of strain S04 showed strong activities against eight pathogens and the inhibition rate of the fermentation product of S04 in Medium C on Hep G2 cell line was up to 100%， which could be a novel resource for the mining of bioactive compounds for further studies.

Key words： Dracaena cochinchinensis， endophytic actinomycetes， antimicrobial activities， antitumor activities， 16S rRNA gene analysis

微生物來源的天然產物在人和動植物疾病中發揮著重要作用，廣泛用作抗細菌、抗真菌和抗腫瘤的臨床藥物，在醫藥行業和農業方面做出了重要貢獻（Katz & Baltz，2016）。已發現3萬多種微生物來源的代謝產物中，約有30%由放線菌所產生，60%由真菌產生，10%由粘細菌產生（Bérdy，2012;Subramani & Aalbersberg，2012）。據保守估計，迄今為止從微生物中發現的次生代謝產物數量僅占其基因組所編碼總數的20%～30%（Ikeda et al.，2003），且自然界中至少90%以上的微生物資源未被人們認識。現在普遍認為，新生境可能蘊藏新物種，新物種可能擁有新基因，新的基因資源可能決定了代謝機制的多樣性和新穎性，從而能極大程度地避免化合物重復發現的問題（Tiwari & Gupta，2012）。近年來的統計發現，從特殊生境微生物中分離到新的活性物質的概率遠高于普通土壤微生物，它們極有可能成為發現新活性先導化合物及新藥的重要來源（Bull et al.，2005）。因此，人們把研究目光轉向棲息于特殊生境的微生物，如海洋、動植物內生環境、高溫熱泉、鹽湖、洞穴等各種極端環境（Zhang et al.，2013;張道鋒，2013;張曉梅，2014）。

植物內生菌（endophytes）是指那些生活史的部分或全部階段生活于健康植物組織內部的真菌或細菌，宿主植物不表現出病癥，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生（朱文勇，2013）。內生菌是一類非常重要的微生物資源，它們具有獨特的分化和發育過程，使其能夠適應植物內部這個特殊的環境，同時它們還能夠編碼產生多種生物活性物質，被廣泛應用于醫藥、工業、農業、食品以及環保等領域。內生菌和高等植物經長時間的協同進化，為適應宿主體內微環境，允許自身與宿主植物之間進行基因信息的交流轉移，使得自身發生遺傳變化，使某些內生菌產生抗生素、植物生長激素等生物活性物質，尤其是一些內生菌還獲得了產生和宿主植物相同或相似化合物的能力，提示我們從植物內生菌尤其藥用植物內生菌中挖掘具有宿主植物相似活性代謝產物的潛力極大。世界范圍內對內生菌研究的關注始于1993年，Stierle從短葉紫杉的內生真菌中發現紫杉醇（Stierle et al.，1993），此后喜樹堿、鬼臼毒素和長春新堿等抗癌明星藥也陸續從其原產植物的內生真菌中發現（Amna，2006）。內生放線菌次生代謝產物的研究較內生真菌少，典型代表是云南美登木內生放線菌 Streptomyces spp.，從中分離得到一系列萘霉素類（naphthomycin K）、巴佛洛霉素類、Ⅲ型聚酮類、大環內酯等類型的新化合物（Lu & Shen，2007;Li et al.，2008;Yang et al.，2012），大部分具有抗菌或抗腫瘤細胞等活性。目前已得到的具有多種生物活性的聚酮類化合物和非核糖體多肽類化合物大多由放線菌產生（Panchanathan et al.，2013）。此外植物內生菌具有產生與宿主同樣或不同的活性次級代謝產物的能力，對于新藥產生途徑以及藥用植物的保護都具有重要意義。

劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis）廣泛分布于我國（云南、海南、廣西）及其他東南亞國家，被列入我國國家重點保護野生藥材物種名錄，屬國家Ⅱ級保護植物，《中國植物紅皮書—稀有瀕危植物（第一冊）》（1992年）將其收錄為漸危種。龍血樹樹脂藥用，可提取中醫傳統外傷科用藥“龍血竭”，在治療心血管病、抗炎、抗腫瘤、治療子宮內膜異位癥及止血活血等方面具有較好的療效。然而，劍葉龍血樹生長緩慢，血竭產量低，收獲血竭會嚴重破壞百年生長的植物。本文將研究劍葉龍血樹內生放線菌的抗菌和抗腫瘤生物活性，篩選并鑒定活性顯著的菌株，并對其發酵條件進行考察，為下一步從中發掘新型抗菌抗腫瘤活性成分奠定基礎，并對瀕危名貴野生藥材劍葉龍血樹的保護有一定意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 內生放線菌 以中國云南西雙版納及越南地區劍葉龍血樹植物組織中分離得到的300余株內生放線菌為材料，由云南大學云南省微生物研究所提供。

1.1.2 病原指示菌 金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC25923）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC6633）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus 1029）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）、銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa PA01）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium χ 8956）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC29212）、曼胞不動桿菌（Acinetobacter baumanii ATCC19606）、克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia ATCC13883）、白色念珠菌（Canidia albicans SC 5314）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum） 、炭黑曲霉菌（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉菌（Aspergillus westerdijkiae），以上菌株均為課題組前期保存。

1.2 腫瘤細胞株

人乳腺癌腫瘤細胞株MCF-7及人肝癌腫瘤細胞株Hep G2 購買自美國模式培養物保藏中心（ATCC， Boulevard， Manassas， VA 20110 USA）。

1.3 培養基

1.3.1 病原細菌培養基 LB：tryptone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.6。

1.3.2 病原真菌培養基 沙保氏培養基：glucose 40 g，peptone 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 6.0。PDA：potato 200 g （ 煮沸 20 min 后過濾，取汁棄渣），glucose 20 g，agar 15 g，ddH2O 1 L，pH 6.0～7.0。

1.3.3 放線菌活化增殖培養基 YMG：yeast extract 4 g，glucose 4 g，malt extract 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.6。

1.3.4 發酵培養基 Medium A：mannitol 20 g，peptone 20 g;Medium B：oat 20 g，trace salt 1 mL;Medium C：potato 200 g （ 煮沸 20 min 后過濾，取汁棄渣），glucose 10 g;Medium D：yeast extract 4 g，glucose 4 g，malt extract 10 g;Medium E： peptone 2 g，beef extract 3 g，yeast extract 3 g，glycerol 10 g，K2HPO4 1 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 1 g;Medium F：soluble starch 10 g，glucose 2 g，yeast extract 2 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，（NH4）2SO4 1 g，CaCO3 2 g，NaCl 1 g，trace salt 1 mL;Medium G：soluble starch 2 g，glucose 20 g，yeast extract 2 g，peptone 2 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 2 g， NaCl 4 g;Medium H：soluble starch 20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4· 7H2O 0.01 g。以上培養基均為1 L，pH7.2～7.6，agar 15 g。

1.3.5 腫瘤細胞培養基 DMEM培養基。

1.4 主要試劑和儀器

蒸餾水，無水乙醇、甲醇、冰乙酸、乙酸乙酯、丙酮等均為分析純。N-1000 旋轉蒸發儀（EYELA，日本），THI-300 恒溫培養搖床（上海一恒科技有限公司），BSA124S 分析天平（德國賽多利斯集團），SW-CJ-2FD 潔凈工作臺（中國蘇州安泰AIRTECH公司），ES-315高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY，日本），DHG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司），LRH-250 生化培養箱（上海一恒科技有限公司），SK5200H超聲儀（上海科導）。

1.5 方法

1.5.1 內生菌優勢菌株的篩選 放線菌在YMG培養基上培養4 d，用含菌的瓊脂塊擴散法進行放線菌抗病原細菌活性篩選;用平板對峙法進行抗真菌活性篩選;用SRB法測定菌株的細胞毒性。分別用A3F/A7R（700～800 bp）、K1F/M6R（1 200～1 400 bp）、KsaF/KSaR （613 bp）引物進行PCR篩選非核糖體肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因（Qin et al.，2009）。

1.5.2 優勢菌株的分類分析 對篩選出的陽性菌株進行基因組提取， 利用細菌 16S rRNA 基因通用引物PA： 5′-CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3′，PB：5′-AGG AGG TGA TCC AGC CGC A-3′進行PCR擴增。擴增條件：94? ℃預變性 5 min;30個循環（94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min） ，72 ℃延伸 3 min;72 ℃總延伸 6 min。得到的 PCR產物經0.8%瓊脂糖膠回收后送生工生物工程 （上海）股份有限公司測序，得到的序列經EzBioCloud （http：//www. ezbiocloud.net/）中的EzTaxon在線比對服務進行相關標準菌株的相似性搜索，確定菌株的分類學地位，并調出相關放線菌的16S rRNA基因序列，隨后用Clustal X進行序列比對，最終用MEGA 6軟件Neighbour-Joining 法構建系統發育樹。

1.5.3 優勢菌株產活性代謝產物發酵培養基的優化

1.5.3.1 菌株發酵及提取 內生放線菌接種于YMG培養基平板上，28 ℃恒溫培養箱倒置培養3～4 d做為菌種，挑取適量菌絲分別接于A-H 培養基 （25 mL·plate-1），每株菌每種培養基發酵 100 mL，于28 ℃恒溫培養箱倒置培養，14 d后將瓊脂切塊于三角燒瓶中，用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸 （80∶15∶5）浸泡過夜提取三遍，把瓊脂過濾后在旋轉蒸發儀上減壓濃縮回收溶劑，用有機溶劑將粗提物轉至樣品瓶，等溶劑完全揮發后，稱重計算產量，樣品備用。

1.5.3.2 生物活性檢測 病原指示菌分別接種至液體LB培養基，白色念珠菌于28 ℃，其余病原細菌于37 ℃，220 r·min-1 震蕩培養18 h。用LB液體培養基分別對各指示菌菌液進行梯度稀釋，稀釋至濃度為 1× 106～1×107 個·mL-1。

采用牛津杯法測定各菌株不同發酵粗提物的體外抗菌活性，指示菌用涂布法或混菌法準備。每個粗提物用 4 mL 丙酮溶解，分別取 50 μL 進行活性測定，取50 μL LB培養基做陰性對照，取50 μL 丙酮做空白對照，取等體積抗生素溶液做陽性對照（病原細菌以5 μg利福霉素為陽性對照;白色念珠菌用20 μg氟康唑為陽性對照）。白色念珠菌于28 ℃培養，其余病原細菌于37 ℃培養，24 h后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑大小。

劍葉龍血樹內生放線菌具有較好的抑菌和抗腫瘤活性，發酵條件明確，菌株易培養且菌種穩定，開發利用前景廣闊，部分菌株活性代謝產物的挖掘工作正在積極進行中。

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（責任編輯 周翠鳴）