HPLC法測定不同產地和品種檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林含量

涂勛良 張利 秦帆 萬斌 呂秀蘭

摘 要：? 該研究建立了同時測定檬苦素和諾米林含量的高效液相色譜法，并采用該方法對8種不同檸檬樣品中檸檬苦素和諾米林含量進行了測定。色譜條件如下：安捷倫Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）色譜柱，流動相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為

30 ℃，波長為210 nm。結果表明：3個產地尤力克果皮中檸檬苦素含量依次為云南瑞麗（EUR_D）、四川安岳（EUR_C）和廣東河源（EUR_Y），諾米林含量依次為EUR_D、EUR_C和EUR_Y;不同品種檸檬果皮中檸檬苦素含量依次為北京檸檬（M_NM）、粗檸檬（R_NM）、無核檸檬（S_NM）、熱那亞（RNY）、里斯本（LSB），諾米林含量依次為S_NM、R_NM、LSB、RNY和M_NM。綜上結果表明，不同產地和品種檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林含量均存在不同程度差異，該HPLC法可為不同產地和不同品種檸檬果實質量鑒別、資源評價及深度開發提供理論依據。

關鍵詞： 檸檬， 檸檬苦素， 諾米林， 高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號：? Q946

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）05-0744-07

Determination of limomin and nomilin of different varieties of lemon peel from different areas by HPLC

TU Xunliang1， ZHANG Li3， QIN Fan1， WAN Bin1， L Xiulan2*

（ 1. Horticulture Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China; 2. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China; 3. College of Sciences， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， Sichuan， China ）

Abstract：? This study established an high-performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of limonin and nomilin in Citrus limon， and the contents of limonin and nomilin in eight different lemon samples was determined by this method. The chromatographic condition was performed on an Agilent Eclipse XDB-C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） column. The mobile phase consisted of 0.1% aqueous phosphoric acid （A） and acetonitrile （B） was invoked as gradient elution with the flow rate at 1.0 mL·min-1. The column temperature was set at 30 ℃ and the detection wavelength was set at 210 nm. The results were as follows： The content of limonin in the lemon peel of three producing areas was Ruili， Yunnan （EUR_D）， Anyue， Sichuan （EUR_C） and Heyuan， Guangdong （EUR_Y） respectively， while the content of nomilin was EUR_D， EUR_C and EUR_Y; The content of limonin in different varieties of lemon peel was Meyer lemon （M_NM）， Rough lemon （R_NM）， Seedless lemon （S_NM）， Genoa （RNY） and Lisbon （LSB）， while the content of nomilin were S_NM， R_NM， LSB， RNY and M_NM. The results displayed that the content of limonin and nomilin in lemon peel from different areas and varieties was different. The HPLC method can provide a theoretical basis for the quality identification， resource evaluation and in-depth development of lemon fruits from different areas and varieties.

Key words： Citrus limon， limomin， nomilin， high-performance liquid chromatography （HPLC）

檸檬苦素類似物（limonoids）是存在于蕓香科（Rutaceae）和楝科（Meliaceae）植物中的一類具有呋喃環并且高度氧化的三萜類次生代謝產物（Maier et al.， 1977）。在柑橘屬中主要有苷元和糖苷兩大類（潘利華等， 2007），它們是引起柑橘屬果汁泛苦的主要原因之一。迄今已從柑橘屬中分離出38種類似物和21種配糖體（Manners， 2007），常見的有檸檬苦素（limomin）、諾米林（nomilin）、奧巴叩酮（obacunone）、諾米林酸（nomilinic acid）和脫乙酰諾米林（deacetylnomilin）等。諾米林在植物莖韌皮部合成并轉移至其他組織（Moriguchi et al.， 2003），在酶的作用下，通過不同生物合成途徑合成檸檬苦素、醋酸檸檬苦酯、宜昌根辛和卡拉敏等類似物（蔡護華和橋永文男， 1996）。檸檬苦素類似物具有抗癌（Tanaka et al.， 2000;Miller et al.， 2004）、抗氧化（Sun et al.， 2005;Zou et al.， 2016）、抑菌（羅水忠等， 2006;李彪等， 2012b）、抗炎鎮痛（溫靖等， 2007）、除蟲殺蟲（李彪等， 2012a）、抑制HIV病毒復制（Battinelli et al.， 2003;Yu et al.， 2015）、降低膽固醇等多種生物活性。

目前，檸檬苦素類似物主要測定方法有分光光度法（田慶國和丁霄霖， 1999）、放射免疫測定法（Mcintosh， 2000）、薄層色譜法（Ohta et al.， 1993）、毛細管膠束電色譜方法（Raynor et al.， 2015）、快速色譜法（flash chromatography）（Raman et al.， 2005）、高效液相色譜法（Bilal et al.， 2013;Breksa et al.， 2015;Manners et al.， 2015）、LC/MS（Manners et al.， 2004;Woo et al.， 2006）、LC-ToF/MS（Yu et al.， 1993）。Bilal et al.（2013）采用HPLC法測得血橙中檸檬苦素為479.77 μg·mL-1，粗檸檬中諾米林為54.23 μg·mL-1，甜橙‘succari中諾米林僅為0.37 μg·mL-1。孟鵬和鄭寶東（2012）采用UPLC法測得檸檬苦素含量依次為琯溪蜜柚>臍橙>尤溪金柑>柑橘，諾米林含量依次為臍橙>琯溪蜜柚>柑橘>尤溪金柑。彭騰等（2012）采用RP-HPLC法測得檸檬苦素含量依次為沙糖桔（金堂）>蜜橘（廣元）>蜜橘（龍泉）>椪柑（新津）>椪柑（金堂）>廣柑（青白江）>蜜橘（蒲江）。

為了提高檸檬副產物的高效利用率，促進檸檬產業蓬勃發展，本研究選取了3個不同產地和5個不同品種檸檬為供試材料，采用HPLC法對檸檬苦素和諾米林含量進行定性和定量分析，發現不同檸檬果品間的含量差異，為檸檬品種鑒定、資源開發利用提供理論依據，從而提高檸檬果品的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

樣品為相同成熟度的成熟檸檬果實，檸檬樣品信息詳見表1。將果肉與果皮分離，果皮樣品經冷凍干燥→粉碎后備用。

BT124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）;FW-80高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）; LC-20AB型高效液相色譜儀 （日本Shimadzu公司）;LGJ-12冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司）;SB-600DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;UPH-Ⅱ-20T超純水機（四川沃特爾水處理設備有限公司）;索氏提取器。

對照品檸檬苦素（批號MUST-13021606）、諾米林（批號MUST-12072101）購自成都曼思特生物科技有限公司，化學結構式如圖1所示，各標準品純度均滿足定量檢測需求;乙腈（色譜純，美國Fisher公司）;磷酸、丙酮和石油醚（60～90 ℃）（均為分析純）購自成都科龍化工試劑廠;自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）;流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脫：10%～50% B（0～10 min），50%～60% B（10～20 min），60%～90% B（20～25 min），90%～10% B（25～35 min，10% B（35～40 min）;流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：210 nm;柱溫：30 ℃;進樣體積：10 μL。

1.2.2 對照品溶液制備 精確稱量對照品檸檬苦素2.83 mg、諾米林2.54 mg，分別用80%丙酮溶解到10 mL容量瓶中，超聲使其充分溶解，定容，配成283 mg·L-1檸檬苦素和254 mg·L-1對照品儲備液。吸取適量對照品儲備液采用梯度稀釋法配制了系列質量濃度的混合標準溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 用定量濾紙包好冷凍干燥后的果皮樣品，用石油醚（60～90 ℃）在索氏提取器內徹底脫脂24 h，將脫脂樣品置于干燥器中，待石油醚（60～90 ℃）完全揮發，樣品干燥后取出備用。稱取0.5 g上述粉末，置具塞錐形瓶中，加入80%丙酮溶液10 mL，稱重，超聲（80 W，40 kHz，50 ℃）1.5 h，冷卻后用80%丙酮補重。0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液備用。

2 結果與分析

2.1 HPLC色譜結果

混合對照品與EUR_C供試品溶液的HPLC色譜圖詳見圖2。在1.2.1條件下，檸檬苦素和諾米林分離度均大于1.8，分離效果極佳，目標峰對稱性好。

2.2 標準曲線的建立

在1.2.1條件下，平行測定各質量濃度按1.2.2制備的混合對照品溶液3次，取其峰面積平均值，以對照品質量濃度為X坐標，平均峰面積為Y坐標，繪制標準曲線。結果顯示檸檬苦素和諾米林在一定質量濃度范圍內與相應峰面積之間線性關系良好（表2）。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 在1.2.1條件下，重復測定6次按1.2.2制備的混合對照品儲備液，結果顯示檸檬苦素和諾米林平均峰面積的RSD分別為0.88%、0.95%，說明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 在1.2.1條件下，取按1.2.2制備的EUR_C供試溶液，分別于0、2、4、6、8、12和24 h后進行HPLC分析，結果顯示檸檬苦素和諾米林平均峰面積的RSD分別為0.76%、1.02%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.3 重現性試驗 在1.2.1條件下，重復測定6次按1.2.2制備的EUR_C供試溶液，結果顯示檸檬苦素和諾米林平均峰面積的RSD分別為0.63%、0.78%，說明該方法重現性較好。

2.3.4 加標回收率試驗 在1.2.1條件下，在EUR_C供試溶液中加入定量的對照品儲備液，重復測定6次，由表3可以看出，檸檬苦素和諾米林的加標回收率分別為100.36%、99.79%;RSD分別為1.07%、1.12%，說明該方法準確度較高。

2.4 不同產地檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林含量測定結果

在1.2.1條件下，參照1.2.2制備供試品溶液，對不同產地尤力克檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林進行定量和差異性分析，結果見表4。

由表4可知，不同產地尤力克果皮中檸檬苦素和諾米林含量存在不同程度的差異。云南瑞麗和四川安岳兩地的尤力克檸檬果皮中檸檬苦素的含量沒有差異，含量分別為0.421和0.418 mg·g-1，廣東河源的尤力克檸檬果皮中檸檬苦素的含量為0.337 mg·g-1，與云南瑞麗和四川安岳兩地的含量呈顯著差異;不同產地對尤力克檸檬果皮中諾米林含量的影響較大，其中云南瑞麗的含量最高，為0.269 mg·g-1，其余兩地依次是四川安岳（0.219 mg·g-1）和廣東河源（0.070 mg·g-1），云南瑞麗與四川安岳兩地的含量呈顯著差異，且均與廣東河源產地的含量呈極顯著差異。

2.5 不同品種檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林含量測定結果

在1.2.1條件下，參照1.2.2制備樣品溶液，對不同品種檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林進行定量和差異性分析，結果見表5。

由表5可知，不同品種檸檬果皮中檸檬苦素和諾米林含量差異顯著。北京檸檬中檸檬苦素的含量與其他4個品種存在極顯著差異，達到0.589 mg·g-1，其余依次為粗檸檬（0.464 mg·g-1）、無核檸檬（0.393 mg·g-1）、熱那亞（0.334 mg·g-1）、里斯本（0.326 mg·g-1），且粗檸檬與無核檸檬、熱那亞、里斯本也存在極顯著差異，而后三者之間無差異。里斯本、熱那亞和北京檸檬的諾米林含量存在顯著差異，含量分別為0.203、0.130、0.050 mg·g-1，而無核檸檬和粗檸檬與前三者含量之間的差異極顯著，且兩者之間差異極顯著，含量分別為0.688、0.386 mg·g-1。

3 討論與結論

高效液相色譜法（HPLC）是測定檸檬苦素類似物最常用的方法之一。Manners et al.（2015）建立了同時測定不同柑橘種子中17種檸檬苦素類似物含量的高效液相色譜法;劉亮等（2007）建立了同時測定柑橘中檸檬苦素和諾米林含量的高效液相色譜法。本研究建立了同時測定不同檸檬果品中檸檬苦素和諾米林含量的高效液相色譜法，采用常規的乙腈-磷酸緩沖體系可在20 min內完成檸檬苦素和諾米林的同時測定。該方法操作簡單，具有較好的精密度、重現性、穩定性及高回收率等特點，可作為測定檸檬果品中檸檬苦素和諾米林含量的常規分析方法，為檸檬果實質量評價提供理論依據和手段。

檸檬苦素類似物研究主要集中在不同類型柑橘比較，少有不同產地與不同品種間的比較。本研究對供試樣品中檸檬苦素和諾米林的檢測結果表明成熟檸檬果品中檸檬苦素含量明顯高于諾米林含量，無核檸檬（檸檬苦素：0.393 mg·g-1，諾米林：0.688 mg·g-1）除外。這是因為諾米林是檸檬苦素類似物生物合成途徑的原始前體，檸檬苦素生物合成途徑是柑橘類水果中檸檬苦素類似物的主要代謝途徑（蔡護華和橋永文男，1996），諾米林含量的降低意味著檸檬苦素含量的升高，形成“此消彼長”的趨勢，該研究結果與此相同。

從本研究結果可以看出，3個產地的尤力克果品中檸檬苦素和諾米林含量存在顯著差異，這與3個產地的氣候條件、水分和土壤等條件息息相關。檸檬樹體生長和果實發育的適宜年均氣溫為17～19 ℃，四川安岳的年均氣溫為18.5 ℃，年均降水量為924.9 mm，正是檸檬生長的最佳適宜條件，安岳年產檸檬鮮果70萬t，占全國總產量的80%，排全世界第8位，綜合上述因素，安岳被稱為“中國檸檬之鄉”。從5個不同品種檸檬的比較實驗結果可得出檸檬苦素含量依次為北京檸檬>粗檸檬>無核檸檬>熱那亞>里斯本，諾米林含量依次為無核檸檬>粗檸檬>里斯本>熱那亞>北京檸檬。8個檸檬果品中檸檬苦素和諾米林的含量差異顯著，其累積規律與不同產地的生態氣候條件、不同品種、不同部位、不同生長發育階段、不同采收期及采后儲運等諸多因素密不可分。隨著檸檬多元化的功能性產品開發，有待進一步對檸檬種植資源進行綜合的品質評價，建立完善的質量評價體系。依據不同品種活性成分含量的差異，培育并栽培推廣專用型的檸檬品種，具有廣泛的市場前景。

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（責任編輯 周翠鳴）