衣康酸對膿毒癥小鼠急性腎損傷的保護作用

焦志華 步莉娜 陳軍 鄒鋒 歐陽元明

[摘要] 目的 觀察膿毒癥急性腎損傷小鼠腎組織炎性因子的變化規律并探討衣康酸對膿毒癥小鼠炎性因子的影響以及對脂多糖（LPS）誘導的小鼠急性腎損傷的保護作用。 方法 雄性C57BL/6小鼠24只，根據隨機數字表法將其分為三組：空白對照組、LPS組、衣康酸+LPS組，每組各8只。衣康酸+LPS組腹腔給予50 mg/kg衣康酸，空白對照組和LPS組腹腔給予等量生理鹽水。給藥2 h后，空白對照組注射等量的生理鹽水，其他兩組小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）。24 h后，麻醉小鼠，留取腎組織備用。腎組織切片蘇木精-伊紅染色觀察腎損傷程度。酶聯免疫吸附試驗法檢測血漿中白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的變化。Western blot法檢測腎組織中細胞外調節蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38和P65蛋白的磷酸化程度。結果 LPS處理24 h后，LPS組腎損傷評分，髓過氧化物酶活性，血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，腎組織中ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平均高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），而衣康酸+LPS組低于LPS組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 衣康酸對LPS誘導的急性腎損傷有保護作用，可能是抑制絲裂原活化蛋白激酶信號通路介導的炎性反應。

[關鍵詞] 衣康酸;急性腎損傷;絲裂原活化蛋白激酶信號通路;炎性反應

[中圖分類號] R36;R392;R91? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0022-05

The protective effect of Itaconic Acid on acute renal injury in sepsis mice

JIAO Zhihua? ?BU Li′na? ?CHEN Jun? ?ZOU Feng? ?OUYANG Yuanming

East Hospital， Shanghai Sixth People′s Hospital， Shanghai Health Medical College， Shanghai? ?201306， China

[Abstract] Objective To observe the changes of inflammatory factors in renal tissue of sepsis mice with acute kidney injury and to investigate the effect of Itaconic Acid on inflammatory factors in sepsis mice and the protective effect on lipopolysaccharide （LPS） induced acute kidney injury in mice. Methods A total of 24 male C57BL/6 mice were divided into three groups： blank control group， LPS group， and Ttaconic Acid + LPS group， with 8 mice in each group. A total of 50 mg/kg of Itaconic Acid was given to the abdominal cavity of the Itaconic Acid + LPS group， and the same amount of normal saline was given to the abdominal cavity of the blank control group and the LPS group. After 2 h of administration， the mice in the blank control group were injected with the same amount of normal saline， and the mice in the other two groups were intraperitoneally injected with LPS （10 mg/kg）. After 24 h， the mice were anesthetized and kidney tissue was taken for reserve. Renal tissue sections were stained with hematoxylin-eosin to observe the degree of renal injury. Serum levels of interleukin （IL） -1， IL-6 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Phosphorylation levels of extracellular regulatory protein kinase （ERK）， c-Jun amino-terminal kinase （JNK）， P38 and P65 proteins in renal tissues were detected by Western blot. Results The renal injury score， MPO activity， the levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in the plasma， the levels of ERK， JNK， P38 and P65 protein phosphorylated in the renal tissue of LPS group were higher than those of the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. While those of Itaconic Acid + LPS group were lower than LPS group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Itaconic Acid has a protective effect on LPS-induced acute kidney injury， possibly by inhibiting the inflammatory response mediated by the mitogen-activated protein kinase signal pathway.

[Key words] Itaconic Acid; Acute kidney injury; Mitogen-activated protein kinase signal pathway; Inflammatory response

嚴重膿毒癥是導致約50%重癥患者發生急性腎損傷（AKI）的主要原因[1-2]。即使是感染較輕的患者，AKI的發病率也高達16%～25%。根據嚴重程度，由膿毒癥引起的AKI的死亡率高達50%～60%[3-4]。膿毒癥AKI的特點是腎臟過濾血液和清除氮廢物的能力迅速下降，通常在膿毒癥發作后數小時至數天內發生變化[5]。對病理生理機制的了解有限，阻礙了對膿毒癥引起的AKI的有效治療的發展[6]。然而，早期感染源控制和支持性護理，使用血管升壓藥、靜脈輸液和腎臟替代治療（RRT）似乎是合理的，但對膿毒性AKI患者并不能產生有利的治療效果[7]。炎性反應在AKI的出現、加重和預后中起關鍵作用，包括內皮細胞和腎小管細胞釋放炎癥介質，炎癥細胞浸潤，以及有毒分子對腎小管的破壞作用[8]。

巨噬細胞在炎性反應過程中產生大量的衣康酸，該物質最近被稱為免疫調節代謝物[9]。此外，研究顯示[10]衣康酸及其衍生物可以抑制炎性反應，減輕組織損傷。然而，其在AKI中的作用及具體的分子機制尚未闡明。

急性腎損傷的發病機制尚不明確，但炎性反應扮演了重要的角色，本研究目的在于探討脂多糖（LPS）誘導的AKI模型中衣康酸的作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級C57BL/6小鼠，雄性，7周齡左右，體重19 g左右，購自上海交通大學附屬醫學院，動物合格證號：SCXK（滬）2018-0007。動物倫理由上海交通大學附屬醫學院倫理委員會批準，符合相關規定。購買后小鼠于控制條件下飼養，自由進食標準飼料和水。嚴格根據國家《實驗動物管理條例》進行動物實驗。

1.2 主要試劑和抗體

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β和IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒購于Invitrogen公司（生產批號分別為：BMS607-3、BMS6002、KMC0061）;髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒購于Abcam公司（生產批號：ab105136）。

細胞外調節蛋白激酶（ERK）、磷酸化細胞外調節蛋白激酶（p-ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、P38、p-P38、P65、p-P65抗體購買于Cell Signaling Technology（Danvers，MA）公司（生產批號分別為：4695T、4370T、9252T、4668T、9212S、4511T、8242T、3031S）;衣康酸購自Merk Millipore（Germany）公司（生產批號：J29204）。

1.3 實驗小鼠分組和處理

SPF級雄性C57BL/6小鼠共24只，根據隨機數字表法分為3組：空白對照組、LPS組、衣康酸+LPS組，每組各8只。衣康酸+LPS組腹腔注射衣康酸（50 mg/kg）[11]，空白對照組和LPS組腹腔給予等量生理鹽水;給藥2 h后，空白對照組注射等量生理鹽水，其他兩組腹腔注射LPS（10 mg/kg）[12]。24 h后，將小鼠麻醉，用生理鹽水進行心臟灌注后，將右腎取下并放入液氮速凍，再放入-80℃冰箱保存，為后續分子生物學檢查做準備;左腎用10%甲醛固定24～48 h，送病理科進行鏡檢[13-14]。

1.4 腎組織病理學蘇木精-伊紅（HE）染色檢測

小鼠左腎取材后，用10%的甲醛將腎組織浸泡24～48 h，隨后將處理好的左腎進行石蠟包埋，用切片機切片（厚度為4 μm）。切片后進行HE染色，并在光學顯微鏡下觀察腎組織形態學改變[15]。腎組織病理切片出現管狀上皮增生、刷狀緣消失、空泡化、腎小管擴張及破裂、細胞溶解和細胞壞死，證實急性腎損傷動物模型造模成功[16]。

1.5 腎損傷評分

每高倍鏡視野隨機選擇10個有病變的腎小管，按100個腎小管記分，由上海市第六人民醫院東院2名病理科醫生在雙盲的情況下單獨進行評分。評分標準參照既往文獻[17]（腎小管損傷定義為：管狀上皮增生，刷狀緣消失，空泡變性，管型形成，及上皮脫落。0分：正常形態;1分：腎小管受損面積≤25%;2分：腎小管受損面積>25%～50%;3分：腎小管受損面積 >50%～75%;4分：腎小管受損面積>75%～100%。

1.6 ELISA法檢測血漿中炎性因子的變化

按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書完成以下步驟：①標準品的稀釋與加樣;②加樣;③溫育;④配液;⑤洗滌;⑥加酶;⑦溫育、洗滌;⑧顯色;⑨終止;⑩測定并計算。加入終止液混勻后即刻測量光密度（OD值）450 nm（3 min內）。每個標準品和標本的OD值應減去空白孔的OD值，手工繪制標準曲線，以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點，通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

1.7 腎組織MPO活性的檢測

將小鼠腎組織加入生理鹽水制成10%的組織勻漿，離心后取上清液，按照MPO檢測試劑盒說明書的說明和步驟進行檢測，打開分光光度計在460 nm處讀取OD值，記錄各管OD值。

MPO活性計算公式：MPO活性（U/g）=（測定管OD值-對照管OD值）/（11.3×取樣量g）。

1.8 Western blot檢測蛋白含量

組織裂解后，使用BCA法進行總蛋白定量，調整蛋白濃度至10 μg/μL，-20℃保存。蛋白上樣量 為15～30 μg，10%～12%的分離膠電泳后，利用電轉膜儀轉膜，轉膜條件為恒流250 mA，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后進行封閉：5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗封膜后室溫下搖1 h然后放入4℃冰箱過夜，二抗室溫孵育1 h。按照1∶1的比例混勻ECL顯影液，均勻滴在PVDF膜上，靜置30 s顯影。

1.9 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，并進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎組織HE染色

空白對照組腎間質和皮質未見炎癥細胞浸潤，未見腎小管上皮細胞病理改變。LPS組和衣康酸+LPS組可見腎皮質和間質出現炎癥細胞浸潤，大部分腎小管上皮細胞出現腫脹，空泡變性，但衣康酸+LPS組病理學改變較LPS組輕。LPS組腎損傷評分高于空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;衣康酸+LPS組腎損傷評分高于空白對照組，但低于LPS組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 三組腎組織MPO活性及血漿炎性因子比較

LPS組MPO活性及血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;衣康酸+LPS組MPO活性及血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于LPS組，差異有統計學意義（P < 0.05）;衣康酸+LPS組MPO活性、TNF-α及IL-6高于空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），但兩組IL-1β比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 Western blot檢測三組腎組織中ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平

LPS組ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平高于空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;衣康酸+LPS組ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平低于LPS組，差異有統計學意義（P < 0.05）;衣康酸+LPS組與空白對照組比較，ERK、JNK、P38和P65蛋白磷酸化水平差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

3 討論

在不同的致病因素中，不同類型AKI的機制可能不同，但炎癥、凋亡和氧化應激參與了缺血再灌注損傷和LPS誘導的AKI[18]。LPS常被用于膿毒癥導致AKI的機制研究，在動物模型中可引起強烈的炎性反應和氧化應激[19]。

AKI的體內和體外模型中已經證實核因子-κB （NF -κB）激活[8，20]。越來越多的研究顯示[21]，NF-κB在AKI相關炎癥和其他細胞的事件中扮演關鍵的角色。LPS刺激腎小管上皮細胞產生炎癥介質、自由基和其他破壞因子;NF-κB激活后表達多種促炎細胞因子;最終導致腎功能不全[22]。既往有研究報道[23-24]，通過降低炎性反應的強度，AKI動物模型的腎損傷可以得到明顯的改善，因此，有效地清除炎癥介質，包括TNF-α、IL-15和IL-6，是治療敗血癥性AKI的有效手段。

本研究也觀察到腎組織中LPS引起的急性腎損傷、腎組織炎性因子的升高;腎組織ERK、P38和JNK蛋白的磷酸化水平升高以及NF-κB激活。腹腔預先給予衣康酸能顯著降低LPS引起的急性腎損傷、腎組織炎性因子的升高;降低腎組織ERK、P38和JNK蛋白的磷酸化水平以及NF-κB激活。

基于本研究，筆者認為衣康酸在LPS引起的AKI中發揮重要保護作用。另外，應該更深入的探討衣康酸在AKI中的作用，考慮將衣康酸作為抑制AKI的治療藥物。

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（收稿日期：2020-02-06? 本文編輯：劉永巧）