藥用植物紫錐菊葉的顯微鑒別研究

王德民，李敏，李峰

（山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355）

紫錐菊［Echinacea purpurea（L.）Moench］，又稱松果菊，為菊科松果菊屬植物，該屬植物已知的有9個種及數個變種［1］，目前被作為藥物開發應用的主要有紫錐菊、狹葉紫錐菊［Echinacea angustifolia（DC.）Hell］和淡紫松果菊［Echinacea pallida（Nutt.）Nutt］［2］。紫錐菊原產于北美，是西方國家民間的傳統草藥，藥用歷史悠久，最早可追溯到北美洲的印第安人時期，用來治療蛇蟻叮咬及皰疹［3］。現代科學研究證明，紫錐菊兼具突出的抗感染和促免疫作用［4-8］。從20世紀開始，紫錐菊作為廣受矚目的免疫調節劑和免疫抑制劑受到國際社會的普遍認可；含有紫錐菊的藥物制劑先后在德國、美國、加拿大等西方國家上市，并擴大應用到保健品及食品領域中，以紫錐菊為原料的產品年銷量常年名列前茅，是國際上公認的免疫和抗病毒雙效草藥［9，10］。20世紀70年代，我國將紫錐菊作為觀賞花卉引入，并首次收載于《北京植物志》中［11］；90年代，紫錐菊首次作為免疫調節劑被肖培根院士介紹到國內，隨即在我國南北多地相繼開始該屬三種藥用植物的栽培研究工作，并取得了一定的成果［3，12］。2012年6月，紫錐菊及其制劑被農業部批準為國家一類新獸藥，并收載于《中華人民共和國獸藥典》［11］。紫錐菊為多年生草本植物，多采收于枝葉繁茂的盛花期，目前國內市場上流行的生藥大宗通貨多由其花、莖、葉等地上部分組成。有學者對該植物不同生長期主要有效成分菊苣酸等的含量進行動態分析發現，盛花期該植物的主要有效成分達到最高值，且葉為含量最高部位［13］。

目前國內有關紫錐菊的研究報道較傳統中草藥相對較少，主要集中在生藥學［2，4］、有效成分［5-8］、藥理藥效［3］等方面，對紫錐菊葉的系統研究鮮有報道，而且目前對紫錐菊葉的顯微鑒別描述尚存在一定分歧，尤其對葉橫切面的內部結構、表皮非腺毛種類等的觀察結果有所異議［9，13-15］。因此，筆者從表面特征、內部結構、粉末特征方面對紫錐菊葉進行系統的顯微鑒別研究，以期為紫錐菊的相關研究和開發應用提供更多的數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

本實驗所用樣品于2019年5月取自山東中醫藥大學藥用植物園，由山東中醫藥大學生藥系李峰教授鑒定為菊科植物紫錐菊［Echinacea purpurea（L.）Moench］的新鮮葉片。

所用藥劑為水合氯醛、稀甘油等。所用儀器包括顯微鏡系統（CX41 System Microscope，OLYMPUS公司產品）；顯微數碼相機（TOUPCAMTM，P/N TP603100A）；成像軟件（ToupView）；高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司，FW-100）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉表面制片 取紫錐菊成熟葉一片，清理表面灰塵后將葉片置于適量蒸餾水中浸泡30 min，取出吸去多余水分，撕取葉片中部近中脈一側的葉上下表皮，迅速浸入蒸餾水中。上、下葉表皮分別制片。將所制備的裝片置于顯微鏡下觀察、描述，并對顯著特征進行拍照。

分別隨機選取相同倍數下觀察到的葉上、下表皮視野各10個。按《中華人民共和國藥典》（2015）通則中的公式I＝（S×100）/（E+S）計算氣孔指數，其中，I表示氣孔指數，S表示氣孔數，E表示同一視野內表皮細胞數。最后取平均值作為最終結果。

1.2.2 葉橫切面制片 取樣品成熟葉一片，清理表面灰塵后切成1 cm×2 cm的短段，置于蒸餾水中浸潤后用刀片重復切片，切至肉眼觀察呈半透明狀。選擇較完整的切片制作臨時裝片，方法同葉表面制片，置于顯微鏡下觀察、拍照并描述。

1.2.3 葉粉末制片 取樣品葉片適量，清理表面灰塵后進行干燥并粉碎，過60目篩，用水合氯醛、稀甘油制成臨時裝片，置于顯微鏡下觀察、拍照、描述。

2 結果與分析

2.1 紫錐菊葉表皮特征

紫錐菊葉上表皮細胞呈不規則多角形，長51～110μm，寬25～59μm，垂周壁呈微波狀彎曲，排列緊密，氣孔偶見，為不定式，周圍副衛細胞3～4個。下表皮細胞呈不規則形，長52～100 μm，寬20～65μm，垂周壁樣式為深波狀彎曲，氣孔眾多，為不定式，保衛細胞半月形，周圍副衛細胞3～4個，可見兩個氣孔共用一個副衛細胞（圖1）。表皮非腺毛偶見，分為四種：第一種為多細胞圓錐狀，先端銳尖，壁較厚，細胞腔狹小，表面具有明顯的疣狀突起；第二種為多細胞棒狀，壁略厚，先端較鈍，表面有疣狀突起；第三種為單細胞圓錐狀，先端銳尖，壁厚，細胞腔狹小，表面光滑；第四種為星狀毛，偶見。葉上表皮的氣孔指數為1.455；葉下表皮的氣孔指數為19.884（表1）。

表1 紫錐菊葉表皮氣孔指數

2.2 葉橫切面特征

通過顯微鑒別，紫錐菊葉為典型的異面葉。上、下表皮細胞各一列，近似長方形，外有角質層覆蓋，細胞外有非腺毛疏被；氣孔上、下表皮均有，下表皮數量遠大于上表皮。葉肉組織分為兩種，分別為柵欄組織和海綿組織，柵欄組織位于葉上表皮內側，組織細胞有兩列，呈長柱形，外層細胞排列較內層更為緊密；海綿組織位于葉下表皮內側，組織細胞多列，形狀不規則，排列疏松，有較大的細胞間隙；葉肉組織中含有大量的葉綠體；中間可見維管束存在。主脈處上、下表皮細胞呈類圓形或類方形，細胞外也有角質層覆蓋，內側為厚角組織，細胞壁不均勻加厚；主脈維管束發達，為外韌型，呈弧形，數量1～3個不等，具有明顯的形成層，薄壁細胞組成一層維管束鞘包圍在維管束外側（圖2）。

圖2 紫錐菊葉橫切面特征顯微觀察

2.3 葉粉末特征

紫錐菊葉粉末為淺綠色。非腺毛可見四種，一為多細胞圓錐狀，先端銳尖，壁較厚，細胞腔狹小，表面具有明顯的疣狀突起；二為多細胞棒狀，壁略厚，先端較鈍，表面有疣狀突起；三為單細胞圓錐狀，先端銳尖，壁厚，細胞腔狹小，表面光滑；四為星狀毛，偶見。表皮細胞形狀不規則，垂周壁呈微波狀彎曲或深波狀彎曲，不定式氣孔，周圍副衛細胞3～4個。保衛細胞半月形，且可見有兩個氣孔共用一個副衛細胞。導管多數以螺紋導管為主，網紋導管偶見。部分可見石細胞。多見角質樣物質，有明顯的不規則線狀紋理。偶見未成熟的花粉粒（圖3）。

圖3 紫錐菊葉粉末顯微觀察

3 討論與結論

紫錐菊并非傳統的中草藥，且引入我國時間相對較短，故國內目前對紫錐菊的生藥研究相對較少，多圍繞其化學成分及藥效藥理作用開展，且受眾目標多為家禽畜類。近年來，隨著紫錐菊在國內引種栽培技術的不斷提高和其生藥商品流通性的不斷增加，該屬植物的“中國化、中藥化”進程也隨之加深，為紫錐菊這種舶來品逐漸探索出中醫藥理論依據［16］。雖然當前國際上該種植物的應用范圍正在不斷擴大，國內相關領域學者也加深了對其的研究，并取得了一定的研究結果，但紫錐菊還未作為藥用植物收錄到《中華人民共和國藥典》中，因而目前國內未有規范、專屬性強的鑒別方法。國內對紫錐菊葉的研究在該屬植物的生藥學等宏觀角度中有所涉及［14］，但缺乏單獨對紫錐菊葉進行研究的報道；也有科研人員［17］采用掃描電鏡對其葉部進行研究，但該方法所需設備成本較高，操作相對復雜，不具有普適性；已發表文獻中紫錐菊葉面結構類型的鑒別結果存在差異。因而，對紫錐菊葉進行相對獨立的研究就顯得尤為重要。

本研究對紫錐菊葉進行了顯微結構的觀察，對葉片上、下表皮分別進行單獨觀察、拍照、描述，并計算氣孔指數。結果表明，紫錐菊葉組織結構特征具有菊科植物的共性，葉上、下表皮細胞形狀、垂周壁、不定式氣孔、副衛細胞數目、維管束類型等均與相關文獻報道［9，15］基本一致；其葉上表皮的氣孔指數1.455，下表皮氣孔指數19.884。

同時也有一些值得商榷的地方：第一，觀察中發現紫錐菊葉的非腺毛有四種，除前人［9］觀察到的多細胞圓錐狀和多細胞棒狀以外，還觀察到了單細胞圓錐狀和星狀毛。第二，紫錐菊葉為異面葉而非報道［14］中的等面葉，柵欄組織僅存在于上表皮內側。第三，觀察發現主脈維管束有分離的情況，個數1～3個不等，主脈維管束的個數與維管束在主脈中位置有關，也與葉片的大小和發育程度有關，即同一葉片，主脈從葉基部至葉尖端，維管束逐漸分離；相同發育程度下不同葉片的相同位置，較大的葉片中維管束分離的占大多數，較小的葉片維管束多不分離；不同發育程度葉片的相同位置，發育成熟葉片的維管束多分離，未發育成熟葉片的維管束多不分離。第四，首次在紫錐菊葉粉末中觀察到石細胞。第五，在紫錐菊葉粉末中觀察到角質層樣物質，該物質具有明顯的不規則線狀紋理。第六，關于紫錐菊葉粉末的研究，有文獻［18］指出其粉末中含有草酸鈣簇晶和草酸鈣柱晶，此次觀察未發現有這兩種物質；在紫錐菊葉粉末中，還偶見未成熟的花粉粒。以上所列觀點，或與相關文獻記載不符，或未見于文獻記載。

同為菊科紫錐菊屬的狹葉紫錐菊和淡紫松果菊，在《美國藥典》中均有收錄，可作為制劑研發的正品植物來源，本課題組其他研究中樣品收集情況的反饋表明，國內目前栽培種以紫錐菊與狹葉紫錐菊為主，淡紫松果菊少有種植（尚未發表）。將狹葉紫錐菊和淡紫松果菊以往研究資料［14，19］與本研究中紫錐菊葉片顯微研究結果橫向對比發現，葉部顯微存在以下異同點：①在橫切面觀察中，狹葉紫錐菊和淡紫松果菊的葉面類型為等面葉，上下表面均為柵欄組織；而本研究中紫錐菊為異面葉。②葉中脈維管束，三種植物均為外韌型，形成層可見。③三種植物上下表皮均發現多細胞非腺毛，且非腺毛種類相同；本研究中觀察到的非腺毛類型為四種，首次發現單細胞圓錐狀和星狀毛。④在葉片粉末觀察中，三種植物的氣孔類型均為不定式。其中，葉面類型的異同可考慮作為紫錐菊與狹葉紫錐菊、淡紫松果菊的顯微鑒別要點。

本研究結果可作為對紫錐菊相關研究內容的補充與完善，為紫錐菊的研究提供了更加全面的參考資料。